浸润性肺腺癌的病理形态学及其基因异质性研究

摘要

以表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂为开端，转化性研究迅速填平肺癌基础实验和临床实践之间的鸿沟。EGFR-TKI极大地延伸了肿瘤学家治疗EGFR突变型肺癌的手段，但TKI持续用药后难以避免地终将出现耐药。Yachida分析胰腺癌的瘤内异质性，结果发现原发灶中存在、但不同于非转移细胞的克隆群体能够促使疾病转移，呈树状模型进化，故“进化突变”普遍存在于转移病灶、原发灶内区域分布的亚克隆。Swanton等通过肾细胞癌多时点和多区域采样及全外显子测序，构建主干-分支树形图，引发肿瘤异质性的研究热潮。
　　故本研究主要分以下内容:
　　第一，分析临床数据，探究肺腺癌病理亚型与驱动基因突变的关联性。方法:回顾性搜集在2011年1月至2015年4月、就诊广东省肺癌研究所、手术切除的浸润性肺腺癌患者（单原发1112例，双原发91例）。以TCGA数据库中141例有主要病理亚型及全外显子测序的肺浸润性腺癌作为验证。结果:贴壁、腺泡、乳头生长方式为主型腺癌多见于女性、非吸烟患者(P＜0.001)。实性及微乳头亚型腺癌的无进展生存期最短（11.6vs.10.5个月）。高级别亚型的腺癌，EGFR突变(26.7％)低、KRAS突变高(14.3％，P＜0.001)。结论:高级别病理亚型为主的润性肺腺癌患者、生存预后最差，KRAS基因突变率高。
　　第二，探索肺腺癌瘤内不同病理亚型区域间的驱动基因异质性。
　　方法:入组患者术前影像为实性和磨玻璃影混合成分、病理示混合亚型且存在常见基因改变。切割每例肿瘤最大径标本、分为若干具有单一病理亚型的区域。EGFR和KRAS突变使用ARMS/HRM和直接测序(direct sequencing，DS)，FISH法检测EML4-ALK融合。结果:EGFR突变的瘤内异质性，60例腺癌中分别为13.3％(DS，8/60)、1.7％(ARMS，1/60)(P=0.016);5例肺腺鳞癌，DS为40％(2/5)，ARMS未测出。KRAS突变的瘤内异质性，10例腺癌中为20.0％(2/10)，HRM未测出。5例肺腺鳞癌，两法均未未测出。结论:非小细胞肺癌病灶内不同病理亚型区域之间、其EGFR/KRAS突变或ALK融合的瘤内异质性较为少见。单区域采样、高灵敏度方法检测，足以代表瘤灶内驱动基因突变状态的全貌并指导治疗。
　　第三，探索肺腺癌瘤内不同病理亚型区域间、基因突变谱的异质性。方法:入组术后病理诊断为浸润性肺腺癌、至少同时含贴壁样和腺泡样生长方式（3例单原发及3例双原发）。如上述取材，进行目标区域测序及突变分析、进化树分析、GO和通路功能富集。结果:同一肿瘤病灶内的不同区域之间的单核苷酸变异、同质性更高。区域间共同发生的突变数目及突变频率、均明显多于病理亚型间共有的突变。贴壁样亚型的共有基因突变频率、特有基因突变数目较高。进化树分析显示，各肿瘤发生、发展的树干基因和枝叶基因改变不同，存在瘤内、瘤间基因异质性。树干基因突变多为同一瘤灶内的不同区域之间所共有。贴壁样区域大多位于肿瘤病灶的边缘区，其枝叶基因突变比例较高。贴壁样生长方式区域的基因突变与细胞增殖、肿瘤形态学进展等相关;腺泡样生长方式区域的基因突变多集中于代谢相关的过程，尤其是相邻肿瘤细胞之间的联系和竞争。结论:浸润性肺腺癌灶内不同级别的病理形态学特征之间进展遵循“树干-枝叶”进化模型。

目录

摘要

1 肺癌流行病学

2 肺癌的靶向治疗及耐药机制研究

3 肿瘤的时空异质性

4 肿瘤形态学的空间异质性

5 瘤内形态学异质性与基因异质性的关联

第一部分 肺浸润性腺癌的不同病理亚型、驱动基因突变与临床预后的分析

1 材料与方法

1．1 病例筛选

1．2 腺癌病理诊断

1．3 统计方法

2 结果

2．1 临床特征

2．2 生存分析

2．3 病理亚型与驱动基因

2．4 数据库分析对比

3 讨论

4 结论

第二部分 浸润性肺腺癌的瘤内驱动基因异质性

1 材料与方法

1．1 病例筛选及标本取材

1．2 病理评估

1．3 DNA提取

1．4 EGFR及KRAS突变基因检测

1．5 EML4-ALK融合检测

1．6 统计分析方法

2 结果

2．1 临床特征

2．2 瘤内基因异质性分析

3 讨论

4 结论

第三部分 肺腺癌瘤内不同病理亚型区域的分子进化机制

1 材料与方法

1．1 病例筛选

1．2 样本取材

1．3 DNA提取及建库

1．4 突变检测

1．5 系统进化树分析及基因功能富集分析

2 结果

1．1 基因谱特征

1．2 CNV及SNV聚类分析

2．3 系统进化树分析

1．3 信号通路及GO功能富集分析

3 讨论

4 结论

全文总结

不足与展望

参考文献

攻读学位期间成果

致谢

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