DLK1基因在肺癌中异常表达的机制研究；多灶肺腺癌EGFR/KRAS基因突变异质性的研究

摘要

本文主要从以下几个方面进行论述：
　　第一章 DLK1基因在肺癌中异常表达的机制研究
　　肺癌的发病例和死亡率均位居第一位，严重威胁人类生命健康。本研究组前期将人类全基因组表达谱芯片分析结合侵袭相关信号通路分析，构建了肺鳞癌侵袭转移相关共表达分子网络，从中筛选出DLK1基因;并从mRNA和蛋白水平证实了DLK1在非小细胞肺癌组织中表达水平高于癌旁对照组织。对于DLK1基因在肿瘤侵袭和转移方面的功能的初步研究，则提示DLK1能够促进肺癌侵袭转移。
　　本项研究作为前期工作的延续，探究DLK1基因在非小细胞肺癌中表达上调的机制;从三个方面对DLK1和非小细胞肺癌发生发展的关系进行补充完善:首先对DLK1在非小细胞肺癌组织中的印迹状态做了鉴定;其次，从转录水平对可能调节DLK1基因的转录因子进行了分析;最后，从DLK1的相互作用蛋白入手，探讨了DLK1在信号通路之间的交流影响方面所承担的分子角色。
　　在5个肺癌细胞系和30例非小细胞肺癌患者的组织中，利用MSP技术对DLK1基因的印迹调控区IG-DMR的甲基化情况进行了检测，发现DLK1在肺癌细胞系中未发生印迹丢失——在肿瘤组织、癌旁对照组织和自身白细胞中，它们的印迹状态一致。由此说明“印迹丢失”应该不是DLK1在肺癌中表达上调的原因。
　　通过转录因子预测和Notch信号通路分析，推断HEY1作为调控DLK1基因转录的蛋白。以肺癌细胞系A549和H1299为研究对象，利用基因转染和RNA干扰技术，体外检测DLK1和HEY1之间的相互影响。结果显示DLK1基因mRNA水平可影响HEY1基因的表达;但HEY1蛋白水平改变不影响DLK1基因mRNA的表达;因此，HEY1很可能不是DLK1基因的转录因子。根据上述实验结果，以及本研究组此前的工作（待发表资料）提示，其基因启动子区异常甲基化状态很可能是DLK1在非小细胞肺癌中表达上调的分子机制。
　　为探究DLK1对Notch信号通路的影响，体外实验通过蛋白免疫共沉淀和细胞免疫荧光共定位分析，证实DLK1蛋白与NCOR1蛋白可以发生相互作用，并且在细胞中定位一致。而从NCOR1对Notch和NF-κB的影响来看，DLK1和NCOR1的相互作用很可能参与了Notch和NF-κB信号通路直接的交流。这一推测还需要后续研究验证。
　　综上所述，本项研究发现印迹基因DLK1在非小细胞肺癌患者肿瘤组织的异常表达并非由印迹异常引起;HEY1虽然被预测可结合于DLK1基因上游CpG岛，但很可能不是作为转录因子调节DLK1基因表达;DLK1蛋白可以与NCOR1蛋白发生相互作用，并可能参与了Notch和NF-κB信号通路之间的交流，有待后期验证。
　　第二章 多灶肺腺癌EGFR/KRAS基因突变异质性的研究
　　分子靶向治疗已成为21世纪人类应对癌症重要的手段及研究方向。对于部分非小细胞肺癌患者，EGFR基因靶向药物是改善生活治疗的有效手段。由于EGFR突变检测是患者对其酪氨酸激酶抑制剂治疗的有效预测指标，具有个体针对性的、准确、全面的EGFR/KRAS基因突变检测显得尤为重要。
　　本实验室前期对6例同时性多灶肺腺癌患者的基因组测序工作显示，在同时性多灶肺腺癌患者的不同病灶间EGFR、KRAS基因突变存在一定异质性。目前突变检测模式一般仅对多灶肺腺癌手术切除的最大病灶或肿瘤细胞含量较高的一个病灶进行EGFR/KRAS基因突变检测，这很有可能会遗漏那些存在EGFR敏感突变的病灶，而使部分患者丧失接受TKIs药物靶向治疗的机会。
　　本项研究利用直接测序法，在58例多灶肺腺癌共129个病灶中对EGFR/KRAS基因突变情况做了检测，比较分析了这组病例的分子病理学检测结果，以明确多灶肺癌不同病灶中EGFR/KRAS基因的突变状态。研究结果显示，129个肺内病灶中，EGFR突变占58.6％，KRAS突变占8.6％;EGFR突变类型主要为19外显子部分缺失突变、21外显子p.L858R;KRAS突变类型主要为p.G12A;38个携带突变的病例中有21个病例出现病灶间突变状态或类型不一致，比例为55.3％;有6个病灶同时存在2种EGFR突变类型;未见KRAS和EGFR突变同时发生于一个病灶。
　　上述研究资料提示，EGFR与KRAS突变在多灶肺腺癌的不同病灶间存在异质性，且EGFR的不同突变类型可发生于同一病灶。由此提示，针对多灶肺腺癌患者应该开展更加全面、精准EGFR/KRAS基因突变检测，以便为患者提供更加个体化的多种治疗选择。

目录

图表索引

英语缩略词

摘要

第一章 DLK7基因在肺癌中异常表达的机制研究

1．1．导论(含文献综述)

1．1．1．DLK1基因在恶性肿瘤中的研究进展

1．1．2．印迹基因与肿瘤易感性的研究

1．1．3．ENCODE计划在转录因子研究中的应用

1．1．4．本课题的研究目的和基本策略

1．2．实验结果

1．2．1．DLK1基因在非小细胞肺癌细胞系中的印迹情况

1．2．2．DLK1基因在非小细胞肺癌组织中的印迹情况

1．2．3．DLK1基因转录因子的预测

1．2．4．HEY1对DLK1蛋白表达水平的影响

1．2．5．DLK1相互作用蛋白初探

1．3．讨论

1．3．1．DLK1基因基本信息

1．3．2．DLK1在非小细胞肺癌中的异常表达机制

1．3．3．NF-κB与NOTCH信号通路间交流在恶性肿瘤发生发展中的影响

1．4．本章小结

第二章 多灶肺腺癌EGFR／KRAS基因突变异质性的研究

2．1．导论(含文献综述)

2．1．1．EGFR基因与靶向治疗研究进展

2．1．2．EGFR／KRAS基因突变检测方法进展

2．1．3．本课题的研究目的和基本策略

2．2．实验结果

2．2．1．EGFR／KRAS基因在多灶肺腺癌中的突变情况

2．2．2．肺内病灶EGFR／KRAS基因突变情况及患者的临床特征

2．3．讨论

2．3．1．EGFR通路信号传导

2．3．2．EGFR／KRAS基因突变与非小细胞肺癌治疗的敏感性和耐药性

2．3．3．EGFR／KRAS基因突变异质性在多灶肺腺癌的诊断和治疗中的意义

2．4．本章小结

第三章 材料与方法

3．1．实验材料

3．1．1．细胞系

3．1．2．肺癌患者组织标本及相关信息

3．1．3．菌株和质粒载体

3．1．4．PCR引物

3．1．5．siRNA和siRNA转染试剂

3．1．6．第一抗体

3．1．7．主要试剂

3．1．8．常用试剂配制

3．1．9．主要仪器、耗材

3．1．10．主要分析软件

3．2．实验方法

3．2．1．分子生物学方法

3．2．2．细胞生物学方法

参考文献

本学位研究课题受下列科研基金资助

致谢

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