白纹伊蚊感染寨卡病毒和登革病毒的媒介能力研究

摘要

背景:
　　寨卡病毒(zika virus，ZIKV)和登革病毒(dengue virus，DENV)是近年来流行较广的蚊媒病毒，可致小头症、格林-巴利综合征、登革出血热和登革休克综合征等严重危害。了解中国能传播ZIKV的蚊媒，明确温度对白纹伊蚊传播DENV-2的媒介能力的影响，对蚊媒疾病的防控具有指导意义。
　　目的:
　　建立ZIKV和DENV-2感染的细胞和蚊虫模型，明确中国埃及伊蚊、白纹伊蚊和致倦库蚊感染ZIKV的媒介能力;对比不同温度下白纹伊蚊感染DENV-2的媒介能力差异。
　　方法:
　　qRT-PCR对比Vero、C6/36、Aag2细胞和乳鼠富集ZIKV的效果;间接免疫荧光确定ZIKV的位置;病毒全细胞悬液、上清液和细胞裂解后的上清液分别与羊血混合喂食白纹伊蚊，确定ZIKV的收集方式;根据最佳条件感染白纹伊蚊，RT-PCR和qRT-PCR检测蚊虫感染ZIKV情况。埃及伊蚊、白纹伊蚊和致倦库蚊感染ZIKV，于感染后0d、4d、7d、10d和14d检测整只蚊虫的ZIKV感染情况和病毒量;另外感染一批蚊虫，于上述各时间点解剖蚊虫中肠、头、唾液腺和卵巢，检测各组织的感染情况和病毒量。C6/36细胞感染DENV-2，观察细胞病变效应;RT-PCR、TCID50和间接免疫荧光检测DENV-2及其滴度;新鲜的病毒上清液与羊血混合喂食白纹伊蚊，RT-PCR检测蚊虫携带DENV-2的情况。吸食DENV-2血餐的白纹伊蚊置于18℃、23℃、28℃和32℃饲养，于感染后0d、5d、10d和15d检测白纹伊蚊中肠、卵巢和唾液腺的DENV-2和病毒量;免疫组化观察32℃、15d的蚊虫中肠和唾液腺。
　　结果:
　　C6/36细胞感染ZIKV于28℃、5d的病毒滴度最高;全细胞病毒悬液与羊血混合喂食白纹伊蚊效果最佳;白纹伊蚊感染ZIKV的阳性率为27.27％～30.77％，且病毒滴度逐渐增高。埃及伊蚊和白纹伊蚊在感染后各时间点保持较高的感染率且病毒滴度逐渐升高，致倦库蚊仅在4d和7d检测到少量的感染和极低的病毒量，7d后未检测到感染;ZIKV在感染后4d可在埃及伊蚊唾液腺检测到病毒，在白纹伊蚊则需要10d。C6/36细胞感染DENV-2置于37℃，2d则出现空泡化，RT-PCR、TCID50和间接免疫荧光证实细胞感染成功;喂食白纹伊蚊，有不同程度的蚊虫感染DENV-2。18℃，DENV-2仅在中肠内缓慢增殖，不能播散至唾液腺。18℃～32℃，随着温度的升高，其播散至卵巢和唾液腺的时间越短，23℃和28℃需要10d，而32℃，5d侵入唾液腺。免疫组化可观察到中肠和唾液腺内的病毒抗原。
　　结论:
　　C6/36细胞为富集ZIKV和DENV-2的理想细胞，两种病毒均能成功感染白纹伊蚊。中国分布的埃及伊蚊和白纹伊蚊可传播ZIKV，而致倦库蚊不能作为ZIKV的传播媒介。白纹伊蚊的媒介能力较埃及伊蚊差，但其在中国广泛分布，白纹伊蚊可能成为中国传播ZIKV的主要媒介。温度是影响白纹伊蚊感染DENV-2媒介能力的重要因素，18℃～32℃，温度越高，病毒在白纹伊蚊增殖越快，其播散至卵巢和唾液腺的时间越短。

目录

摘要

第一章 C6／36细胞和白纹伊蚊感染寨卡病毒体系的建立

1．引言

2．实验材料

2．1 病毒株

2．2 细胞株

2．3 实验蚊虫

2．4 实验动物

2．5 主要试剂和器材

2．6 主要仪器

3．实验方法

3．1 多种细胞感染ZIKV

3．2 乳鼠颅内接种ZIKV

3．3 RT-PCR检测细胞和乳鼠感染ZIKV

3．4 荧光定量PCR检测ZIKV在细胞和乳鼠的增殖情况

3．5 不同病毒收集方式感染白纹伊蚊

3．6 白纹伊蚊感染ZIKV不同时间点的检测

3．7 间接免疫荧光检测细胞内ZIKV的感染

4．结果

4．1 细胞和乳鼠感染ZIKV的检测

4．2 三种病毒收集方式感染白纹伊蚊的比较

4．3 不同时间点白纹伊蚊感染ZIKV的情况

4．4 间接免疫荧光检测细胞感染ZIKV

5．讨论

6．小结

第二章 埃及伊蚊、白纹伊蚊和致倦库蚊感染寨卡病毒的媒介能力检测

1．引言

2．实验材料

2．1 细胞和病毒株

2．2 实验蚊虫

2．3 主要试剂和器材

2．4 主要仪器

3．实验方法

3．1 C6／36细胞富集ZIKV

3．2 埃及伊蚊、白纹伊蚊和致倦库蚊感染ZIKV

3．3 整只蚊虫的感染情况和病毒量的检测

3．4 ZIKV在蚊虫各组织的感染情况和病毒量测定

3．5 统计学分析

4．结果

4．1 埃及伊蚊、白纹伊蚊和致倦库蚊感染ZIKV的感染率和病毒量

4．2 埃及伊蚊、白纹伊蚊和致倦库蚊感染ZIKV的媒介能力

4．3 ZIKV在埃及伊蚊、白纹伊蚊和致倦库蚊各组织的复制情况

4．4 ZIKV在埃及伊蚊、白纹伊蚊和致倦库蚊卵巢的感染和复制情况

5．讨论

6．小结

第三章 C6／36细胞和白纹伊蚊感染登革病毒-2模型的建立

1．引言

2．实验材料

2．1 病毒和细胞株

2．2 实验蚊虫

2．3 主要试剂和器材

2．4 试剂配制

2．5 主要仪器

3．实验方法

3．1 DENV-2经C6／36细胞富集

3．2 RT-PCR检测C6／36细胞感染DENV-2

3．3 TCID50检测DENV-2的滴度

3．4 间接免疫荧光(indirect immunofluorescence，IFA)检测DENV-2感染C6／36细胞

3．5 白纹伊蚊感染DENV-2的检测

4．结果

4．1 DENV-2感染C6／36细胞所致的细胞病变效应

4．2 RT-PCR定性检测DENV-2感染C6／36细胞的结果

4．3 TCID50检测DENV-2感染C6／36细胞的病毒滴度

4．4 间接免疫荧光检测C6／36细胞内的DENV-2

4．5 不同时间点白纹伊蚊感染DENV-2的检测

5．讨论

6．小结

第四章 不同温度对白纹伊蚊感染登革病毒-2的媒介能力的影响

1 引言

2．实验材料

2．1 细胞和病毒株

2．2 实验动物

2．3 实验蚊虫

2．4 主要试剂和器材

2．5 主要仪器

3．实验方法

3．1 C6／36细胞富集DENV-2

3．2 白纹伊蚊感染DENV-2

3．3 不同温度白纹伊蚊感染DENV-2媒介能力的检测

3．4 DENV-2在白纹伊蚊各组织的病毒量测定

3．5 免疫组化检测中肠和唾液腺中DENV-2的存在

3．6 统计学分析

4．结果

4．1 不同温度白纹伊蚊感染DENV-2的媒介能力

4．2 不同温度白纹伊蚊各组织内DENV-2的病毒量

4．3 免疫组化观察的DENV-2在中肠和唾液腺的分布

5．讨论

6．小结

全文总结

参考文献

附录

攻读学位期间成果

致谢

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