68Ga标记蛙皮素衍生物靶向GRP受体的PET显像研究

摘要

研究背景:
　　蛙皮素同人体内的胃泌素释放肽GRP在C端上具有相同的7个氨基酸，与人体内的GRP受体具有很高的亲和力。它们作为自分泌或旁分泌生长因子可以促进肿瘤细胞的增殖，研究发现，多数肿瘤细胞膜上高表达GRP受体，包括前列腺癌、乳腺癌等。通过阻断GRP受体可以切断受体介导的信号传导通路而抑制癌症的生长，这提示GRPR可作为一种理想的分子靶向受体，用于肿瘤的诊断和治疗。但天然的蛙皮素有很多不足之处，因此需对其进行剪切修饰使其更好的用于显像。
　　目的:
　　1.构建一个靶向肿瘤GRP受体的蛙皮素衍生物拮抗剂多肽—DPhe-Gln-Trp-Ala-NMeGly-His-Sta-Leu(主肽，ATBBN)和蛙皮素受体激动剂多肽Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met(对照肽，AGBBN)。
　　2.通过用荧光和68Ga标记制备探针，用荧光显像和microPET/CT显像从细胞、组织和活体整体水平评价分子探针用于前列腺癌及肝细胞癌显像的可行性，如果可以用于显像，也推测可以用于肿瘤的靶向治疗。
　　实验方法:
　　1.采用固相多肽合成方法合成ATBBN和AGBBN，用荧光标记ATBBN合成荧光探针FAM-ATBBN，经高效液相分离、纯化及质谱分析鉴定。选用高表达GRPR的前列腺癌PC3细胞株进行细胞体外实验，使用倒置显微镜、共聚焦显微镜及流式细胞仪进行细胞荧光摄取实验实验，从细胞层面验证多肽的靶向性。建立荷PC3前列腺癌移植瘤模型，并经组织病理学验证，荷瘤裸鼠尾静脉注射FAM-ATBBN于不同时间点进行活体荧光摄取实验，勾画感兴趣区，计算肿瘤/非肿瘤比值。
　　2.采用螯合方法合成PET分子探针68Ga-NOTA-ATBBN、68Ga-NOTA-AGBBN及68Ga-NOTA-PEG4-ATBBN合成产物用HPLC进行纯化、分离和质量控制。经荷PC3前列腺癌及HepG2肝细胞癌移植瘤模型尾静脉注射显像剂后于不同时间点行microPET/CT动静态显像，勾画感兴趣区，用每克组织百分注射剂量率(％ID/g)来表示，计算肿瘤/非肿瘤比值。
　　3.统计学分析
　　采用SPSS21.0统计软件进行分析。肿瘤/非肿瘤比值比较采用两独立样本t检验，P＜0.05认为差异有统计学意义。
　　结果:
　　1.合成的FAM-ATBBN为粉黄色粉末，主峰分子量为1543.1，纯度为99.12％。细胞体外结合试验结果显示:FAM-ATBBN能被PC3细胞膜所摄取，且随着浓度的增加，荧光摄取强度也增加，到达一定浓度后有趋于饱和趋势。裸鼠大体荧光实验显示1小时、2小时、3小时肿瘤病灶呈现明显荧光高摄取，而且肿瘤/脑、肿瘤/心、肿瘤/肺、肿瘤/肝及肿瘤/脾的比值2小时高于1小时(t=-3.818,P=0.019;t=4.597,P=0.010;t=-4.68,P=0.009;t=-2.859,P=0.046;t=-5.628，P=0.032)。
　　2.合成68Ga-NOTA-ATBBN及68Ga-NOTA-AGBBN总标记反应时间为25分钟，未衰变校正的标记产率为50％，比活度是1.1×1010 Bq/mmol;放射性纯度大于92％。microPET/CT显像结果显示荷PC3前列腺癌肿瘤对两种显像剂均有摄取，肿瘤/脑、肿瘤/肌肉的比值较高，但两种显像剂肿瘤/非肿瘤比值差异无统计学意义。
　　3.68Ga标记PEG化的ATBBN放射性纯度为98％，肿瘤与非肿瘤比值稍增高，除了肿瘤/骨骼比值差异有统计学意义，其余肿瘤/非肿瘤比值差异无统计学意义。
　　4.荷HepG2肝细胞癌对68Ga-NOTA-AGBBN有明显摄取，肿瘤/脑、肿瘤/肌肉比值高达3.0以上;免疫组化显示荷HepG2肝细胞癌存在GRPR表达。
　　结论:
　　1.本研究成功地合成荧光分子探针FAM-ATBBN和PET分子探针68Ga-NOTA-ATBBN、68Ga-NOTA-AGBBN及68Ga-NOTA-PEG4-ATBBN;
　　2.体外细胞荧光摄取实验、活体荧光摄取实验及mircoPET/CT显像证实ATBBN靶向前列腺癌GRP受体，肿瘤/脑、肿瘤/肌肉比值高，适合用于前列腺癌显像;
　　3.68Ga-NOTA-ATBBN及68Ga-NOTA-AGBBN两种分子探针micro PET/CT显像结果无明显差异;
　　4.PEG化的ATBBN提高了放射性纯度，但无改善miro PET显像结果;
　　5.microPET/CT显像初步显示荷HepG2肝细胞对68Ga-NOTA-AGBBN有摄取，在肝细胞癌的分子显像中可能具有应用潜能，但需要进一步的实验来验证。

目录

摘要

第一章 蛙皮素及GRPR的研究现状

1．1 蛙皮素与胃泌素释放肽受体(GRPR)

1．2 蛙皮素衍生物

1．3 核素标记蛙皮素衍生物的应用

1．4 PET标记多肽方法的进展

1．5 研究目的和研究路线

第二章 前列腺癌及肝细胞癌诊断现状

2．1 前列腺癌概述

2．2 肝细胞癌概述

第三章 实验内容

3．1 分子探针ATBBN及FAM-ATBBN的合成、纯化及鉴定

3．2 分子探针FAM-ATBBN体内外生物功能的评价

3．3 分子探针68Ga-NOTA-ATBBN， 68Ga-NOTA-AGBBN和68Ga-NOTA-PEG4-ATBBN的micro PET／CT显像

3．4 分子探针68Ga-NOTA-AGBBN在荷HepG2肝细胞癌的micro PET／CT显像

第四章 小结

参考文献

附录

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

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