Kif2a调节小鼠卵母细胞纺锤体组装和减数分裂成熟进程的研究

摘要

Kif2a作为微管解聚酶，在有丝分裂中的双极纺锤体的形成，染色体联会与分离，纺锤体极联合中起到重要作用。到目前为止，Kif2a是否参与减数分裂过程中调节纺锤体组装、染色体运动及分离等仍未知。本研究中，研究了Kif2a在小鼠卵母细胞减数分裂过程中表达、定位和功能。
　　取6-8周ICR雌性小鼠的GⅤ期卵母细胞体外培养;首先对各期卵母细胞进行免疫印迹检测Kif2a蛋白表达、免疫荧光检测Kif2a定位;接着用免疫荧光试验检测Taxol和Nocodazole处理后的中期卵母细胞，以明确Kif2a与微管动力的关系;对卵母细胞进行Kif2a siRNA显微注射，抑制其蛋白表达后采用染色体铺片、冷处理、免疫荧光、免疫印迹等方法研究其在减数分裂成熟中具体作用。三次独立重复的实验用平均数±标准差表示。用SPSS17.0软件进行差异分析，采用独立样本T检验。P＜0.05被定义为差异有显著统计学意义。用ZEN(2012)软件进行荧光强度数据分析。
　　一、Kif2a作为微管解聚酶调节减数分裂纺锤体的组装和染色体排列
　　Western blot结果示:Kif2a在减数分裂成熟各时期均有表达，GⅤ期表达水平较低，从GⅤ期到MⅠ期逐渐上升，MⅡ期有所下降。免疫荧光显示:GⅤ期Kif2a定位于生发泡内。GVBD后，Kif2a聚拢于染色体周围，且染色体着丝粒上检测到较弱信号。MⅠ期和MⅡ期，Kif2a主要定位于纺锤体，并于纺锤体两极及染色体着丝粒处富集。TⅠ期，Kif2a富集于细胞中体上。染色体铺片显示，MⅠ期和MⅡ期Kif2a信号位于染色体内着丝粒处。Taxol处理后，纺锤体微管蛋白高度聚集，并在胞内形成大量胞质星体。免疫荧光发现，Kif2a信号和α-tubulin信号出现重叠，且高度集中在异常的纺锤体极、胞质星体和着丝粒上。以上定位提示，Kif2a可能参与调控纺锤体组装和染色体运动。
　　利用siRNA干扰Kif2a表达后，导致纺锤体严重缺陷（大多数为无极、单极，其次为多极和变宽的纺锤体）;影响卵母细胞纺锤体向皮质迁移;并出现染色体排列异常（延迟分裂和完全排列异常的染色体）。
　　γ-tubulin作为MTOC相关蛋白，是参与减数分裂中微管成束和纺锤体组装的重要蛋白。在Kif2a降调组，γ-tubulin从纺锤体的两极脱落且不规则散布于纺锤体微管或分散于胞浆中。由此推断，Kif2a可能参与纺锤体极聚集。
　　冷处理后，在Kif2a降调组MⅠ期卵母细胞纺锤体中的α-tubulin荧光强度较强，显著高于对照组;说明Kif2a通过其微管解聚酶活性，发挥对微管的解聚作用，参与纺锤体组装调节。
　　二、Kif2a参与小鼠卵母细胞减数分裂进程调控
　　降调Kif2a影响纺锤体组装，引起小鼠卵母细胞第一次减数分裂Pro-MⅠ/MⅠ期阻滞、第一极体排出率下降、大极体排出率增加。进一步探究:染色体是否可以发生正确分离。染色体铺片发现，实验组同源染色体未分离;而对照组同源染色体已经分离，提示减数分裂已进入后期完成阶段。
　　接下来研究了纺锤体检验点(SAC)的重要成分Bub3的分布。Kif2a降调组卵母细胞即使培养10小时，仍阻滞于Pro-MⅠ/MⅠ期，并在染色体上检测到Bub3信号，提示SAC被激活;而对照组卵母细胞进入AⅠ期，且未检测到Bub3信号。
　　CyclinB1的降解和MPF活性缺失是卵母细胞突破MⅠ期进入后期的必要条件。将Kif2a降调组和对照组卵母细胞培养10小时，对CyclinB1进行免疫印迹检测。Kif2a降调后，CyclinB1水平较对照组显著升高，提示:Kif2a降调引起CyclinB1降解异常，从而引起中/后期转化受阻。
　　将Kif2a降调组和对照组细胞培养8.5小时后进行鬼笔环肽-FITC染色发现，对照组染色体位于细胞边缘且检测到微丝帽形成。Kif2a降调组染色体位于细胞中央，未检测到微丝帽形成。可见Kif2a敲减引起微丝帽形成受损。
　　研究结果显示:Kif2a可能作为微管解聚酶和微管组织中心相关蛋白，在小鼠卵母细胞减数分裂过程中纺锤体的组装与迁移、染色体排列、微丝帽形成和第一极体排出中起到重要作用。

目录

摘要

第一部分 研究论文Kif2a调节小鼠卵母细胞纺锤体组装和减数分裂成熟进程的研究

摘要

前言

第一章 Kif2a调节小鼠卵母细胞纺锤体组装

1．材料与方法

2．数据分析

3．实验结果

4．讨论

5．结论

第二章 Kif2a调节小鼠卵母细胞减数分裂进程

1．材料与方法

2．数据分析

3．结果

4．讨论

5．结论

参考文献

第二部分 文献综述

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