遗传性癫痫伴热性惊厥附加症钾通道致病基因捕获验证和海马氢质子波谱改变

摘要

遗传性癫痫伴热性惊厥附加症(Genetic epilepsy with febrile seizures plus，GEFS+)是一个以常染色体显性遗传为主的癫痫综合征，其基因型和表型具有很大的异质性。目前已知的致病基因主要是钠离子通道基因，仍有很多致病基因不明，很多未知致病基因或易感基因需进一步发掘和探索。本研究主要对于GEFS+家系钾通道致病基因研究，应用二代测序加目标基因靶向捕获对钾通道基因捕获、然后进行相关功能验证，寻找GEFS+的致病基因，继而探讨GEFS+与海马氢质子波谱(～H Magnetic resonance spectroscopy,MRS)改变的关系。
　　研究对象及方法:
　　收集2012年1月～2016年12月就诊于广东省人民医院小儿癫痫专科门诊及病房GEFS+患儿，据2001年国际抗癫痫联盟(ILAE)的癫痫及癫痫综合征的诊断标准和GEFS+定义。收集14个GEFS+家系，先证者14人及家系成员共48人，行二代测序加癫痫目标基因靶向捕获技术检测。在一个GEFS+家系发现KCNQ4基因的错义突变(P537S)，应用以上技术再在另13个GEFS+家系和26个热性惊厥(Febrileseizures，FS)先证者及家系验证，通过Sanger测序对发现的KCNQ4突变位点在200例健康人群验证。选取KCNQ4P537S构建质粒脂质体转染HEK293细胞，通过荧光定量PCR比较KCNQ4P537S与KCNQ4野生型组(WT) mRNA水平，Western blot比较KCNQ4P537S与KCNQ4WT蛋白水平，构建Kv7.4 P537S纯合及Kv7.4 P537S/Kv7.3 WT杂合通道，再通过全细胞膜片钳检测Kv7.4 P537S电流与野生型的差异。
　　在此基础上，14例GEFS+先证者行海马MRS检查，计算双侧海马NAA/Cr、Cho/Cr、NAA/(Cho+Cr)值与对照组比较。
　　结果:
　　1.在14个GEFS+家系中，发现一个KCNQ4基因突变c.1609C＞T，位于外显子12上，可导致蛋白质发生如下变异:p.Pro537Ser（脯氨酸→丝氨酸）。另26个FS家系验证中又发现KCNQ4两个突变:c.1177G＞T、c.1207G＞A位于外显子9上，可分别导致以下蛋白质变异:p.Gly393Cys（甘氨酸→半胱氨酸），p.Ala403Thr（丙氨酸→苏氨酸）。每个病人仅携带其中一个突变。以上位点国内外未见报道。
　　2.GEFS+家系外及健康人群验证未发现以上突变。
　　3.荧光定量PCR: KCNQ4 P537S mRNA相对于KCNQ4WT表达量为0.776852，二组mRNA表达量差异比较p值0.1，差异无统计学意义。
　　4.Western blot: KCNQ4 P537S蛋白表达量相对于KCNQ4WT蛋白表达量，二组比较差异p值0.0289，差异有统计学意义。
　　5.膜片钳:细胞膜电压钳制于-90mV,阶跃刺激从-70mV开始至+60mV，步阶10mV，Kv7.4 P537S和Kv7.4 WT组、Kv7.4 P537S/Kv7.3 WT组和Kv7.4WT/Kv7.3 WT组钾离子通道约在电压-70mv开放，当电压达到50mV左右时通道电流达到峰值，Kv7.4 P537S组电流密度为13.27±2.144 pA/pF(n=10)，Kv7.4WT电流密度为25.8±4.147 pA/pF（n=8），二者比较p值0.0116，差异有统计学意义。Kv7.4 P537S组的I-V曲线较Kv7.4 WT组右移。Kv7.4 P537S/Kv7.3 WT组电流密度为32.15±2.622 pA/pF(n=8)，Kv7.4 WT/Kv7.3 WT电流密度为61.69±9.225 pA/pF(n=10)，二者比较p值0.0135，差异有统计学意义。Kv7.4 P537S/Kv7.3 WT组I-V曲线较Kv7.4 WT/Kv7.3WT组右移。Kv7.4 WT的激活曲线V50为14.3mv，而Kv7.4 P537S为11.3mv，二者比较差异无统计学意义。Kv7.4WT/Kv7.3 WT组V50为3.485mv，而Kv7.4 P537S/Kv7.3 WT为9.955mv，二者比较差异有统计学意义，而且Kv7.4 P537S/Kv7.3 WT激活曲线右移。
　　6.本研究GEFS+患儿双侧海马波谱NAA/（Cr+Cho）平均值0.71±0.11，正常对照组0.74±0.10，p值0.214，差异无统计学意义。
　　结论:
　　1.发现一个GEFS+家系KCNQ4基因突变c.1609C＞T，另26个FS家系验证中发现KCNQ4两个突变:c.1177G＞T、c.1207G＞A。
　　2.KCNQ4P537S影响了蛋白质结构的稳定性。
　　3.膜片钳结果显示KCNQ4P537S对细胞膜电位产生影响，电流密度下降，细胞膜上离子通道开放的数目减少，细胞膜复极过程延长，对神经元兴奋活动抑制下降，从而引起神经元兴奋性增高，引起癫痫的发生。
　　4.KCNQ4可能是中国人群GEFS+的新的突变基因。
　　5.本研究GEFS+患儿海马功能磁共振(MRS)未见改变。

目录

摘要

第一部分 遗传性癫痫伴热性惊厥附加症钾通道致病基因捕获及功能验证

第一章 前言

第二章 研究对象及方法

第三章 试剂和仪器

第四章 实验方法

第五章 研究结果

第六章 讨论

第七章 结论

第二部分 GEFS+患儿磁共振波谱改变

第一章 前言

第二章 研究对象及方法

第三章 研究结果

第四章 讨论

第五章 结论

参考文献

综述 钾离子通道与癫痫新进展

攻读学位期间成果

致谢

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