iPS细胞来源的嵌合体胸腺移植对异基因骨髓移植小鼠的T细胞重建和GVHD的影响

摘要

加快异基因骨髓移植(allogeneic bone marrow transplantation，allo-BMT)后T细胞重建能够降低感染和肿瘤复发的几率。胸腺移植(thymus transplantation，TT)作为一种提高胸腺功能、加快T细胞重建的方法，已被临床用于治疗DiGeorge综合征、严重联合免疫缺陷病、艾滋病等疾病。前期研究显示，TT联合allo-BMT不但能够促进T细胞重建，加强抗肿瘤效应，而且不会引起严重的移植物抗宿主病(graft versus host disease，GVHD)。然而胸腺供体来源缺乏制约了TT在allo-BMT的应用。诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cell，iPScells)具有和胚胎干细胞相似的功能，学者们已成功将iPS细胞诱导分化为造血祖细胞、神经元、胰岛β细胞、肝细胞、血管内皮细胞等。iPS细胞技术为培养人工胸腺提供了新思路。目前国内外尚未有将iPS细胞诱导分化为胸腺并运用于异基因骨髓移植的研究报道。
　　研究目的:
　　本课题组前期研究将表达绿色荧光蛋白的C57BL/6小鼠的iPS细胞，通过显微注射到ICR小鼠囊胚腔内，获得的嵌合胚胎移植到代孕雌性ICR小鼠子宫内，最终获得嵌合子代，用iPS细胞成功构建了嵌合体胸腺。本研究首次将嵌合体胸腺用于allo-BMT时的TT，探索其对受体T细胞重建和GVHD的影响。旨在解决TT的来源，并寻找一种加快allo-BMT后T细胞重建的新方法。
　　研究方法:
　　1.异基因骨髓内骨髓移植、胸腺移植和淋巴细胞输注异基因骨髓内骨髓移植（intra-bone marrow-bone marrow transplantation,IBM-BMT）:受体BALB/c小鼠移植前24h均接受X射线全身照射。取C57BL/6小鼠的股骨和胫骨的骨髓细胞(bone marrow cells，BMCs)，制成单细胞悬液。将受体小鼠麻醉，使用微量注射器穿过关节囊将BMC1×107/mouse注入胫骨骨髓腔内。TT:取嵌合体小鼠胸腺，分离为大小约2×2×1mm的组织块，暴露受体左侧肾脏于体腔外，将胸腺组织块置于肾被膜下，逐层缝合肌肉及皮肤。淋巴细胞输注(donorlymphocyte infusion，DLI):取C57BL/6小鼠的脾脏，研磨，计数，通过鼠尾静脉注入5×106/mouse脾脏单细胞悬液。
　　2.IBM-BMT+TT组的供体胸腺和各组GVHD的观察
　　实验分三组:IBM-BMT组，IBM-BMT+TT组，IBM-BMT+DLI组。移植4周后，取移植的供体胸腺行HE染色，观察组织学形态。每周测量小鼠体重2-3次，同时观察GVHD的表现。取受体小鼠的肝脏、小肠、皮肤，10％福尔马林固定，石蜡包埋，切片，HE染色，观察其GVHD的病理变化。
　　3.检测各组T细胞亚群
　　在移植4周后，取受体小鼠外周血，流式细胞仪分析检查植入状态、分析不同实验组T细胞亚群比例。取脾脏，流式细胞仪分析不同组Foxp3+CD4+T细胞的比例。
　　研究结果:
　　1.IBM-BMT+TT组、IBM-BMT+DLI组、IBM-BMT组外周血CD8+T细胞组比例分别为（11.10±1.49）％，（8.49±0.82）％，（5.52±0.83）％，两两组间差异有统计学意义(P＜0.05)。IBM-BMT+TT组的外周血CD4+T细胞比例为（9.60±0.69）％，显著高于IBM-BMT+DLI组的(8.07±0.65)％及IBM-BMT组(6.42±1.40)％(P＜0.05)。
　　2.IBM-BMT+TT、IBM-BMT组的脾脏Foxp3+细胞占CD4+T细胞比例分别为（1.86±0.36）％、（2.29±0.23）％，显著高于IBM-BMT+DLI组（0.07±0.05）％(P＜0.05)。
　　3.IBM-BMT+TT、IBM-BMT组的GVHD临床评分低于IBM-BMT+DLI组，病理学检查GVHD表现更轻。
　　研究结论:
　　1.iPS细胞来源的嵌合体胸腺移植，通过胸腺依赖路径，能有效加快移植后的CD4+和CD8+T细胞数目的恢复，支持Foxp3+CD4+T细胞（即Treg细胞）的发育，促进T细胞重建。
　　2.IBM-BMT+TT组GVHD反应轻，可能是嵌合体胸腺支持Foxp3+CD4+T细胞的产生，抑制GVHD反应。
　　3.iPS细胞来源的嵌合体胸腺移植能促进T细胞重建，并不引起严重GVHD，为解决TT的来源和allo-BMT后T细胞重建迟缓和免疫排斥的提供了新方法。

目录

摘要

前言

一、异基因骨髓移植后的细胞重建

二、异基因骨髓移植后改善胸腺功能的相关研究

1 通过调控胸腺微环境修复胸腺功能的研究

2 胸腺移植的研究

3 人工胸腺的研究

第一章 iPS细胞来源的嵌合体胸腺移植促进T细胞重建

1．1 材料和方法

1．2 结果

1．3 讨论

1．4 结论

第二章 iPS细胞来源的'隈合体胸腺移植对GVItD的影响

2．1 材料和方法

2．2 结果

2．3 讨论

2．4 结论

参考文献

攻读学位期间成果

致谢

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