CCR7基因修饰的未成熟树突状细胞对异基因骨髓移植小鼠GVHD的影响

摘要

目的：构建含有小鼠趋化因子受体-7(chemokine receptor-7，CCR7)的慢病毒表达载体并感染未成熟树突状细胞(immature dendritic cells，imDCs)，观察其对imDCs的免疫表型，刺激T淋巴细胞增殖能力及趋化迁移能力的影响；并通过构建移植物抗宿主病(graft-versus-host disease，GVHD)小鼠模型，观察imDCs对异基因骨髓小鼠急性GVHD的影响。
　　 方法：1、以小鼠胸腺总RNA为模板，RT-PCR扩增出CCR7基因片段，亚克隆pCR-Blunt载体，酶切并DNA测序验证正确后，通过IRES连接GFP报告基因，并连接至慢病毒骨架载体Lv-Lac，建立双顺反子慢病毒转移质粒，命名为Lv-CCR7，酶切鉴定。采用阳离子脂质体法将重组质粒，包装质粒△NRF及包膜质粒pVSVG，共转染293FT细胞，根据报告基因GFP测定病毒滴度，转染48h、72h、96h收集上清，获得携带CCR7基因的重组慢病毒。取C57BL/6小鼠骨髓单个核细胞以含20ng/mL粒-巨细胞集落刺激因子(GM-CSF)的1640完全培养基培养imDCs，并以病毒上清感染imDCs，加或不加细菌脂多糖(LPS)刺激使其成熟，光镜下观察细胞形态，流式细胞术检测细胞免疫表型，MTT法检测淋巴细胞增殖能力，趋化实验检测细胞迁移能力。2、构建异基因骨髓移植小鼠模型，将CCR7基因修饰的imDCs输入异基因骨髓移植小鼠体内，并设立对照组。实验分组如下：①A组：单纯照射（TBI组）；②B组：GVHD对照组；③C组：imDCs组；④D组：Lv-CCR7-imDCs组（CCR7-imDCs组）。观察移植后各组小鼠GVHD临床评分，存活时间，生存率，肝脏、小肠、皮肤组织病理学，异基因嵌合情况。
　　 结果：1．成功构建重组质粒Lv-CCR7，转染293FT细胞12h后在荧光显微镜下观察到EGFP表达，48h、72h和96h收集病毒上清，病毒滴度为108U/L以上，获得携带CCR7基因的重组慢病毒。2．小鼠骨髓单个核细胞在培养24h后大部分贴壁生长，仅见少量悬浮细胞，约4d左右出现半黏附细胞集落，集落逐渐增多、变大，5d时细胞表面出现长短不一毛刺样突起，流式细胞术鉴定DCs低表达CD86、CD80分子，经脂多糖(LPS)刺激后高表达CD86、CD80分子，显示出成熟型DC(mDCs)的表型特征，流式细胞术检测到慢病毒感染后约(63.33±5.87)％的imDCs表达CCR7，表达量高于mDCs，3．体外混合淋巴细胞培养中CCR7基因修饰的imDCs刺激淋巴细胞的增殖能力与imDCs相比无统计学意义(P＞0.05)，而LPS刺激的mDCs显示出很强的刺激淋巴细胞增殖能力，与imDCs相比有显著统计学意义（P＜0.05）。4．体外趋化迁移实验结果表明CCR7感染的imDCs在CCL21作用下其迁移能力明显强于imDCs(P＜0.01)和mDCs(P＜0.05)。5．A、B、C和D组受鼠平均生存时间为(8.0±0.7)d、(10.6±0.9)d、(12.8±1.1)d、(24.3±1.6)d，B、C两组小鼠生存时间比较无统计学意义（P＞0.05），D组小鼠生存时间较B、C组延长（P＜0.01）。受鼠移植后GVHD评分D组较B、C组降低（P＜0.05），B、C组比较无统计学意义（P＞0.05）。B组病理显示肝脏、小肠、皮肤重度GVHD表现，而D组仅有轻微GVHD表现。
　　 结论：1．成功构建小鼠CCR7基因重组慢病毒载体，获得了高滴度的重组慢病毒。2．经含CCR7的慢病毒感染imDCs后，CCR7的表达明显增高，且CCR7基因修饰的imDCs具有很强的趋化迁移能力；3．过继输注CCR7基因修饰的imDCs明显延长了异基因骨髓移植小鼠的存活时间，减轻了小鼠急性GVHD的严重程度。

目录

文摘

英文文摘

缩略词表

前言

第一部分 Lv-CCR7慢病毒载体的构建及鉴定

第二部分 CCR7基因修饰的未成熟树突状细胞的体外培养及鉴定

第三部分 CCR7基因修饰的未成熟树突状细胞对异基因骨髓移植小鼠GVHD的影响

讨论

结论

论文图表

参考文献

趋化因子受体-7的研究进展 综述

参考文献

攻读硕士学位期间发表学术论文

临床培训小结

致谢