血管紧张素Ⅱ在肿瘤乏氧微环境中生成的机制及介导肿瘤辐射抵抗的作用

摘要

目的:
　　研究发现，AngⅡ主要存在于肿瘤的乏氧区域，并且是由肿瘤细胞通过糜蛋白酶(chymase，CMA)依赖的途径产生，而不是ACE依赖的经典RAS途径。并进一步揭示了糜蛋白酶依赖途径受到糖酵解代谢产物——乳酸水平调节，而且在乏氧肿瘤细胞中AngⅡ水平的增加对于HIF-1α在细胞内的累积起重要作用，并介导了乏氧肿瘤细胞的辐射抵抗。这不仅为深入理解头颈部肿瘤乏氧介导的辐射抵抗机制提供新的理论依据，而且为克服头颈部肿瘤放疗抵抗从而减少放疗后残留及复发提供了新的思路和手段。
　　方法:
　　1.检测头颈部肿瘤中血管紧张素Ⅱ在肿瘤乏氧区域的表达
　　运用ELISA实验及细胞免疫荧光实验检测鼻咽癌细胞株和乳腺癌细胞株在体外不同氧环境（常氧及乏氧）下的血管紧张素Ⅱ表达情况。构建裸鼠皮下移植瘤模型，结合HIF-1α抗体，利用免疫荧光技术分析血管紧张素Ⅱ在肿瘤组织中的分布与HIF-1α表达区域的相关性，进而分析AngⅡ与肿瘤乏氧区域的相关性。利用免疫荧光技术分析血管紧张素Ⅱ在人鼻咽癌标本中的分布与HIF-1α表达区的相关性，进而分析AngⅡ与肿瘤乏氧区域的相关性。
　　2.检测乏氧情况下肿瘤细胞产生血管紧张素Ⅱ的机制
　　利用AGT慢病毒载体构建稳定抑制血管紧张素原表达的鼻咽癌细胞株CNE2和5-8F，并运用ELISA实验检测鼻咽癌细胞培养基中AngⅡ的表达。通过皮下注射上述细胞株建立小鼠移植瘤模型，运用免疫荧光技术分析移植瘤组织内AngⅡ与哌莫硝唑标记的肿瘤乏氧区域的相关性。通过荧光定量PCR及Western B1ot技术检测乏氧肿瘤细胞中血管紧张素原(AGT)、肾素(Renin)和血管紧张素转换酶(ACE)的基因及蛋白的表达水平。针对RENIN和ACE各设计3条短干扰RNA片段(siRNA)，使用细胞转染技术抑制细胞中RENIN和ACE的表达。然后利用ELISA实验检测不同氧环境（常氧及乏氧）下鼻咽癌细胞株RENIN和ACE沉默后AngⅡ的表达情况。利用基因表达微阵列分析的方法找出显著影响肿瘤细胞AngⅡ形成的糜蛋白酶(chymase，CMA)，并使用Western Blot进一步证实。然后通过构建CMA的慢病毒载体抑制其表达，使用ELISA实验检测不同氧环境（常氧及乏氧）下鼻咽癌细胞株CMA沉默后的AngⅡ表达情况。
　　3.检测改变培养基pH或加入乳酸是否影响肿瘤细胞血管紧张素Ⅱ的表达
　　通过使用1％盐酸(HCl)和5％碳酸氢钠(NaHCO3)将常氧条件下肿瘤细胞培基pH调整至乏氧条件培养的水平，或者将乏氧条件下肿瘤细胞培基pH调整至常氧条件培养的水平，然后使用ELISA实验检测pH调整后肿瘤细胞培基中AngⅡ表达情况。使用乳酸检测试剂盒检测不同氧环境下（常氧及乏氧）鼻咽癌细胞中乳酸的表达情况，并运用ELISA的实验方法检测不同氧环境（常氧及乏氧）的培养基中加入乳酸钠提高细胞内乳酸水平或者加入草氨酸钠抑制细胞内乳酸生成后鼻咽癌细胞的AngⅡ表达情况。
　　4.检测肿瘤细胞产生的乳酸是否影响糜蛋白酶的表达
　　5.检测乏氧肿瘤细胞中血管紧张素Ⅱ与HIF-1α表达的关系
　　6.检测血管紧张素Ⅱ与头颈部肿瘤细胞辐射敏感性关系
　　7.统计分析
　　结果:
　　1.肿瘤乏氧区域存在局部血管紧张素Ⅱ
　　利用ELISA试剂盒检测鼻咽癌细胞株CNE1、CNE2、5-8F及乳腺癌细胞株MDA-MB-231不同氧浓度下的AngⅡ生成情况。结果显示在体外普通培养条件(常氧)下，肿瘤细胞培养基中可检测到少量AngⅡ生成，而在乏氧培养条件下，肿瘤细胞培养基中AngⅡ水平显著升高。运用细胞免疫荧光技术检测发现常氧条件下培养的CNE2及MDA-MB-231仅有极少量的AngⅡ表达在胞浆中，而乏氧条件下培养的肿瘤细胞胞浆中AngⅡ表达明显升高。在裸鼠的CNE2移植瘤模型中的荧光检测发现AngⅡ主要集中在乏氧诱导因子HIF-1α高表达的乏氧区域。另外我们还收集了13例鼻咽癌肿瘤标本，用激光共聚焦显微镜观察到AngⅡ与HIF-1α表达于鼻咽癌肿瘤标本的同一区域。在AGT稳定敲除的鼻咽癌CNE2细胞的动物移植瘤模型中，我们通过组织免疫荧光检测发现在哌莫硝唑指示的肿瘤乏氧区域AngⅡ的表达明显下降。这些结果均提示局部RAS存在于肿瘤的乏氧微环境中。
　　2.乏氧肿瘤细胞不是通过经典的RAS途径产生血管紧张素Ⅱ
　　荧光定量PCR及Western Blot技术检测发现在鼻咽癌CNE2细胞株中只有肾素在乏氧条件下其基因及蛋白水平显著升高，而AGT与ACE在乏氧条件下与常氧相比具有相似的表达水平。在特异性敲除肾素的CNE2和5-8F鼻咽癌细胞株中，通过ELISA检测发现乏氧情况下两细胞株培养基中的AngⅡ水平降低。而特异性敲除血管紧张素转换酶的CNE2和5-8F细胞株中则无此种改变。这些结果提示我们，在乏氧的肿瘤细胞中AngⅡ的产生可能并不依赖典型的RAS途径。
　　3.乏氧肿瘤细胞通过糜蛋白酶依赖途径产生血管紧张素Ⅱ
　　基因表达微阵列分析结果显示，在乏氧的CNE2细胞中糜蛋白酶转录显著增加，并通过Western Blot进一步得到了证实。我们利用慢病毒载体，构建了稳定敲除CMA的CNE2和5-8F细胞株。ELISA实验结果显示，乏氧培养环境中的鼻咽癌细胞株在CMA沉默后其AngⅡ表达较常氧情况下显著降低。以上研究结果表明，在肿瘤的乏氧微环境中，糜蛋白酶介导AngⅡ的生成途径可能是ACE依赖AngⅡ生成途径的替代通路。
　　4.肿瘤来源的乳酸介导了乏氧肿瘤细胞血管紧张素Ⅱ的产生
　　运用ELISA检测不同氧环境（常氧及乏氧）中鼻咽癌细胞CNE2及5-8F的培养基中加入乳酸钠提高细胞内乳酸水平或者加入草氨酸钠抑制细胞内乳酸生成后其AngⅡ的表达水平。结果显示，用HC1酸化培养基后并未显著增加培养基中AngⅡ的含量，相反，利用5％碳酸氢钠(NaHCO3)将乏氧条件下培养的肿瘤细胞培基pH调整至常氧条件培养的水平后AngⅡ的含量上升。以上研究结果表明酸性pH并不是影响乏氧肿瘤细胞CMA依赖途径生成AngⅡ的主要因素。而乳酸测定的结果显示，乏氧条件培养的CNE2及5-8F细胞中乳酸水平较常氧条件下显著升高。在CNE2及5-8F细胞的培养基中加入乳酸盐后，ELISA检测发现常氧及乏氧条件下的培养基中AngⅡ水平显著增高，加入草氨酸钠后抑制胞内乳酸生成后AngⅡ水平则降低，而挽救实验可恢复两种培养条件下培养基中的AngⅡ水平。这就说明是乳酸而不是pH的降低引起乏氧肿瘤细胞中AngⅡ水平的增加。
　　5.肿瘤产生的乳酸调节肿瘤细胞中糜蛋白酶的表达
　　Western Blot检测结果显示，无论常氧还是乏氧培养条件，在CNE2细胞培养基中加入乳酸盐后其糜蛋白酶的表达增加，加入草氨酸钠后则发生抑制。在CNE2细胞培养基中加入碳酸氢钠碱化培养基后，两种培养条件下的糜蛋白酶亦有所增加。此外，乳酸盐及培养基的碱化也使肾素的表达一定程度上升高。这些研究结果表明，乏氧肿瘤细胞中乳酸水平的增加可能是造成糜蛋白酶表达升高的重要因素。
　　6.血管紧张素Ⅱ调节乏氧肿瘤细胞中HIF-1α蛋白的累积
　　Western Blot实验显示，AngⅡ处理及乏氧条件下的CNE2细胞中HIF-1α蛋白显著升高，而加入坎地沙坦后可抑制HIF-1α蛋白的升高。在AGT稳定敲除的鼻咽癌CNE2细胞的动物移植瘤模型中，我们通过组织免疫荧光检测发现AGT沉默后，大大减弱了HIF-1α蛋白在哌莫硝唑标记的肿瘤乏氧区域中的积累。这些实验结果说明在乏氧肿瘤微环境中AngⅡ参与调节HIF1-α蛋白的累积。
　　7.局部生成血管紧张素Ⅱ介导了乏氧肿瘤细胞的辐射抵抗
　　克隆形成实验显示，乏氧条件下鼻咽癌CNE2及5-8F细胞的辐射抵抗能力较常氧条件下显著增加，而AT1R特异性拮抗剂坎地沙坦能逆转乏氧条件造成的肿瘤细胞辐射抵抗，显著增加其辐射敏感性。裸鼠的CNE2细胞株皮下成瘤实验发现AT1R拮抗剂坎地沙坦处理组较对照组显著减小了10Gy辐射后的肿瘤体积。在AGT稳定敲除的鼻咽癌CNE2及5-8F细胞的动物移植瘤模型中，AGT沉默组小鼠的移植瘤体积在10Gy辐射后较阴性对照组显著降低。这些结果均表明，肿瘤乏氧微环境中AngⅡ的增加介导了肿瘤的辐射抵抗，使用AT1R拮抗剂坎地沙坦可以特异地在乏氧环境下增加肿瘤细胞的辐射敏感性。
　　结论:
　　本研究揭示了局部RAS主要存在于肿瘤的乏氧区域，肿瘤细胞可能主要通过糜蛋白酶(chymase，CMA)依赖的途径产生AngⅡ，而不是ACE依赖的途径，并以自分泌或旁分泌的方式发挥作用。肿瘤细胞来源的乳酸，而非乏氧环境的pH降低，通过激活乏氧肿瘤细胞的肾素及糜蛋白酶的表达引起AngⅡ的生成增加。最后，我们发现AngⅡ可使乏氧肿瘤细胞中HIF-1α蛋白增加，从而介导了肿瘤细胞的辐射抵抗，而坎地沙坦可以特异的增加乏氧肿瘤细胞的辐射敏感性。我们的研究结果不仅为深入理解头颈部肿瘤乏氧介导的辐射抵抗机制提供新的理论依据，而且为克服头颈部肿瘤放疗抵抗从而减少放疗后残留及复发提供了新的思路和手段。

目录

摘要

前言

1 材料与设备

1．1 细胞及动物

1．2 主要试剂及耗材

1．3 主要溶液配制

1．4 主要仪器

2 实验方法

2．1 细胞培养

2．2 细胞复苏、冻存、换液及传代

2．3 细胞辐射

2．4 细胞乏氧

2．5 细胞转染

2．6 细胞总蛋白提取及BCA法蛋白定量

2．7 蛋白印记实验(Western blot)

2．8 克隆形成实验

2．10 乳酸含量测定

2．11 细胞免疫荧光

2．12 裸鼠皮下成瘤实验

2．13 构建稳定敲除AGT、CMA的细胞株

2．14 细胞内总RNA的提取、逆转录PCR和荧光定量PCR

2．15 统计分析

2．17 统计分析

3 实验结果

3．1 肿瘤乏氧区域存在局部血管紧张素Ⅱ

3．2 乏氧肿瘤细胞并不是通过经典的RAS途径产生血管紧张素Ⅱ

3．3 乏氧肿瘤细胞通过糜蛋白酶依赖的途径产生血管紧张素Ⅱ

3．4 肿瘤来源的乳酸介导了乏氧肿瘤细胞血管紧张素Ⅱ的产生

3．5 肿瘤产生的乳酸调节肿瘤细胞中糜蛋白酶的表达

3．6 血管紧张素II可调节乏氧肿瘤细胞中HIF-1α蛋白的累积

3．7 局部生成血管紧张素Ⅱ介导了乏氧肿瘤细胞的辐射抵抗

4 讨论

5 结论

全文小结

参考文献

缩写词简表

致谢

硕士研究生期间发表论文情况

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