阻断C5a/C5aR上调调节性T细胞治疗慢性移植物抗宿主病的实验研究

摘要

目的：
　　探讨阻断C5a/C5aR治疗慢性移植物抗宿主病(cGVe)的疗效，为cGVHD的免疫治疗提供新的实验依据。
　　方法：
　　1.采集异基因造血干细胞移植后cGVHD患者、无cGVHD患者及供者静脉血标本，流式细胞术检测三组外周血淋巴细胞及CD14+单核细胞中C5aR的表达及CD4+CD25+Foxp3+Tregs细胞的比例，并进行相关性分析。
　　2.流式细胞术检测遗传背景相同的C5aR敲除及野生型BALB/c小鼠脾细胞中CD4+CD25+Foxp3+Tregs细胞占CD4+T细胞的比例;体外培养小鼠脾细胞，分为C5aR-/-组、野生型组、Rm C5a蛋白刺激组（分为100ng/mL及500ng/mL Rm C5a+野生型脾细胞两组），分别采用ELISA检测各组培养上清中TGF-β1的分泌水平及流式细胞术检测各组CD4+CD25+Foxp3+Tregs细胞的比例。
　　3.分选C5aR敲除及野生型BALB/c小鼠脾细胞中的CD4+T细胞，设C5aR-/-组及BALB/c组，通过CD3、CD28、IL-2、TGF-β1等细胞因子诱导Tregs细胞分化3天后，检测2组CD4+T细胞中CD4+CD25+Foxp3+Tregs细胞的比例。
　　4.建立小鼠cGVHD模型。通过移植主要组织相容性抗原(MHC)相合、次要组织相容性抗原(miHA)不合的异基因B10.D2雄性小鼠的骨髓细胞及脾脏细胞(8×106，1∶1)→BALB/c雌性小鼠，建立一种能模拟临床cGVHD的小鼠模型。
　　5.以cGVH小鼠模型为研究对象，设对照组及PMX53治疗组2组。随机分配cGVHD小鼠至PMX53治疗组及对照组，每组各6只，+29d时，所有小鼠均出现cGVHD，予PMX53（1mg/kg，每周2次，持续3周）治疗。治疗后临床观察：体重低于14g或到观察终点（移植后+65d）处死小鼠。观察终点进行以下实验：(1)观察2组小鼠cGVHD临床评分、生存时间及组织病理形态学改变。(2)流式细胞术检测两组小鼠脾细胞中C5aR的表达及脾脏CD4+T细胞中CD4+CD25+Foxp3+Tregs细胞的比例。(3)酶联免疫吸附试验(ELISA)检测2组小鼠外周血血浆中TGF-β1的分泌水平。
　　6.统计学分析：应用SPSS20.0软件对数据进行统计学分析。正态分布数据以均数±标准误((x)±SEM)表示。采用One-Way ANOVA比较多组间数据，采用Levene检验方差齐性;各组方差齐时，组间的比较选用可进行多个样本均数间两两均数比较的LSD。比较两组间数据，各组方差齐时，采用两样本t检验比较两组间均数。分析两变量之间的关系采用Spearman相关性分析，Kapplan-Meier法分析小鼠生存时间。检验水准均为：α=0.05。
　　结果：
　　1.cGVHD患者外周血淋巴细胞及CD14+单核细胞中C5aR的表达均显著高于无cGVHD患者及健康供者（淋巴细胞：3.76±0.30％vs2.36±0.55％，1.16±0.16％，P均＜0.001;CD14+单核细胞：94.05±0.52％vs89.51±0.40％，88.53±1.16％，P均＜0.001)，而CD4+T淋巴细胞中CD4+CD25+Foxp3+Tregs细胞的比例明显较无cGVHD患者及健康供者低（1.45±0.13％vs2.97±0.18％，3.16±0.31％，P均＜0.001），健康供者与无cGVHD患者间均无明显差异(P＞0.05);且CD4+T淋巴细胞中CD4+CD25+Foxp3+Tregs细胞的比例与淋巴细胞中C5aR的表达呈显著的负性相关(R=-0.603，P＜0.01)，而与CD14+单核细胞中C5aR的表达相关性分析无统计学差异(R=-0.378，P＞0.05)。
　　2.C5aR-/-促进Tregs细胞的分化，而Rm C5a抑制小鼠脾细胞TGF-β1的分泌及CD4+CD25+Foxp3+Tregs细胞比例：
　　(1)C5aR-/-组小鼠脾脏CD4+T细胞中Tregs细胞比例显著高于野生型小鼠(15.67±0.55vs11.3±0.60％,P＜0.01)。
　　(2)野生型组、100ng/mL及500ng/mL RmC5a蛋白刺激组与C5aR-/-组细胞培养上清中的TGF-β1分别为：879.17±27.42，322.67±25.33，413±217.29和1668±109.79);野生型组脾细胞培养上清中TGF-β1的分泌显著低于C5aR-/-组(P＜0.001)，但明显高于RmC5a蛋白刺激组(P＜0.01)，而100ng/mL与500ng/mLRmC5a蛋白刺激组间TGF-β1的表达无明显差异（P＞0.05）。
　　(3)流式检测显示100ng/mL及500ng/mL Rm C5a蛋白刺激组的CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞在脾脏CD4+T细胞中的比例均显著低于BALB/c组及C5aR-/-组(P＜0.01)，且BALB/c组低于C5aR-/-组(6.91±0.30％vs9.76±0.33％，P＜0.001)：而100ng/mL与500ng/mL RmC5a蛋白刺激组对Treg细胞的表达无明显影响（5.59±0.08％vs5.80±0.03％，P＞0.05）。
　　(4)体外诱导CD4+T向Tregs细胞分化，发现C5aR-/-组Tregs细胞的比例显著高于BALB/c组（34.52±0.69％vs5.60±0.26％,P＜0.001）。
　　3.成功构建cGVHD小鼠模型，使用C5aR阻断剂PMX53治疗cGVHD小鼠：
　　(1)阻断C5aR改善cGVHD小鼠模型临床表现并延长小鼠生存时间。PMX53治疗组小鼠临床评分在治疗后逐渐减低，而cGVHD对照组小鼠临床评分持续加重;PMX53治疗组小鼠生存时间显著高于cGVHD对照组（P＜0.05）。
　　(2)阻断C5aR减轻cGVHD小鼠模型组织病理损伤。cGVHD对照组小鼠皮肤表皮层增生明显，真皮层大量胶原沉积，皮肤广泛炎症细胞浸润，皮下脂肪严重萎缩，毛囊数目明显减少;而PMX53治疗组小鼠显示出相对较轻的病理改变。cGVHD对照组肝脏HE染色显示炎性细胞浸润大部分门管区并伴淋巴细胞浸润胆管，而PMX53治疗组小鼠肝脏门管区较少受累。
　　(3)C5aR阻断剂PMX53下调C5aR表达，上调CD4+CD25+Foxp3+Tregs细胞比例。C5aR在PMX53治疗组小鼠脾细胞中的表达显著低于cGVHD对照组（1.36±0.96％vs3.41±0.29％，P＜0.05），而Tregs细胞比例却显著高于cGVHD对照组（10.56±0.40％vs13.64±0.48％，P＜0.001）。
　　(4)C5aR阻断剂PMX53促进TGF-31分泌。PMX53治疗组小鼠外周血上清中TGF-β1的表达显著高于cGVHD对照组（938.4±12.91vs745.6±24.48，P＜0.001）。
　　结论：
　　1、临床cGVHD患者C5aR高表达，CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例下降，阻断C5a/C5aR补体途径可能为cGVHD提供新的治疗靶点。
　　2、体外下调C5aR可介导TGF-β1的分泌增加，从而上调Tregs细胞的表达，反之，上调C5aR的表达，可介导TGF-β1分泌减少，从而下调Tregs细胞的表达。
　　3、cGVHD小鼠模型C5aR高表达，首次提出C5aR阻断剂PMX53可能通过促进TGF-β1分泌，促进CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞极化，减轻cGVHD的临床与病理学损伤，从而发挥抗cGVHD作用。

目录

摘要

前言

参考文献

第一章 cGVHD患者外周血中C5aR及Tregs细胞的表达

1．1 材料和方法

1．2 结果

1．3 讨论

参考文献

第二章 体外调节C5a／C5aR的表达对Tregs细胞分化及TGF-β1分泌水平的影响

2．1 材料和方法

2．2 结果

2．3 讨论

参考文献

第三章 C5aR阻断剂PMX53治疗cGVHD小鼠模型的体内实验研究

引言

3．1 cGVHD小鼠模型的建立

3．1．1 材料和方法

3．1．2 结果

3．2 C5aR阻断剂PMX53治疗小鼠cGVHD体内实验

3．2．1 材料和方法

3．2．2 结果

3．3 讨论

参考文献

全文小结

英文缩略词

攻读学位期间的研究成果及发表的学术论文

致谢

声明