不同处理方式对小鼠卵母细胞孤雌激活钙离子振荡的影响

摘要

卵母细胞激活在受精和胚胎发育过程中起到关键作用，其中钙离子振荡在卵母细胞激活中起到重要作用。小鼠卵母细胞激活后的钙离子振荡可持续时间长达数小时。钙振荡是卵母细胞从减数分裂转化为有丝分裂过程中的重要事件，能直接影响到原核的形成、胚胎发育和胚胎植入。近年来，很多研究结果表明:钙离子振荡调控着卵母细胞激活的效率和胚胎的后续发育。但目前关于卵龄、激活液的pH值、卵母细胞的成熟方式和卵母细胞内质网应激状态对孤雌激活后钙离子振荡影响的研究还不明确。
　　目的:比较不同处理方式对小鼠卵母细胞孤雌激活后钙离子振荡模式的影响。
　　方法:本研究中，我们用不同的处理方法处理卵母细胞后使用氯化锶激活卵母细胞，并用活细胞工作站记录卵母细胞被激活后的瞬时钙离子浓度变化;用qRT-PCR检测了卵母细胞内质网应激标志物水平。
　　分别收集注射hCG（human chorionic gonadotrophin，人绒毛膜促性腺激素）13h、15h、17h、19h和21h后的卵母细胞，研究不同卵龄对孤雌激活后钙离子振荡的影响;研究激活液不同pH值(pH6.4，pH6.6，pH6.8，pH7.0，pH7.2，pH7.4和pH7.6)对卵母细胞孤雌激活钙离子振荡的影响;另外，比较体外培养17h的裸卵和卵丘-卵母细胞复合物与体内成熟卵母细胞（注射hCG17h后收集卵母细胞）孤雌激活后钙离子振荡方式;最后，我们分别用2.5-50μg/ml的衣霉素诱导卵母细胞发生内质网应激，研究内质网应激对卵母细胞孤雌激活钙离子振荡的影响。
　　结果:实验结果提示注射hCG17h后收集的卵母细胞孤雌激活后钙离子振荡频率最快，钙离子振荡周期最短。激活液的pH值为6.8至7.6时不影响钙离子振荡模式，但pH6.6组和pH6.4组钙离子振荡的频率显著低于pH7.2组，而振荡周期显著高于pH7.2组。此外，体外成熟的卵母细胞与体内成熟卵母细胞相比，其孤雌激活钙离子振荡的频率和峰值显著降低。体外成熟卵丘-卵母细胞复合物组孤雌激活后钙离子振荡的频率和峰值显著高于裸卵组，钙离子振荡的周期显著低于体外成熟裸卵组。然而，在体外成熟的卵丘-卵母细胞复合物卵母细胞孤雌激活后钙离子振荡的频率和峰值水平均低于体内成熟的卵母细胞。最后，我们用2.5-50μg/ml衣霉素诱导卵母细胞的内质网应激，结果发现衣霉素诱导的内质网应激影响钙离子振荡模式，表现为钙离子振荡周期显著延长和频率显著降低。
　　结论:实验结果提示不同卵龄，激活液的pH值和卵母细胞成熟方式是影响孤雌激活钙离子振荡的关键因素。同时内质网应激损害了小鼠卵母细胞孤雌激活后的钙振荡模式。

目录

摘要

第一章 前言

1．1 卵母细胞激活

1．2 卵母细胞钙离子振荡

1．2．1 卵母细胞钙离子振荡的形成

1．2．2 卵母细胞钙离子振荡形成的机制

1．2．3 钙离子振荡对胚胎发育的影响

1．3 卵龄对胚胎发育的影响

1．4 pH值对胚胎发育的影响

1．5 卵母细胞的体内成熟与体外成熟

1．5．1 卵母细胞的体内成熟

1．5．2 卵母细胞的体外成熟

1．6 内质网应激对卵母细胞的影响

1．6．1 内质网应激的形成

1．6．2 内质网应激对卵母细胞的损伤机制

1．7 卵母细胞的孤雌激活

1．7．1 孤雌激活的作用

1．7．2 孤雌激活后胚胎的发育潜能

1．7．3 孤雌激活的方法

1．7．4 卵母细胞孤雌激活的影响因素

1．7．5 孤雌激活的发展前景

第二章 材料和方法

2．1 研究对象

2．2．1 主要试剂

2．2．2 主要设备

2．2．3 试剂的配制

2．3 实验方法

2．3．1 卵母细胞的收集

2．3．2 卵母细胞的体外培养

2．3．3 激活液pH值的调节

2．3．4 卵母细胞的孤雌激活

2．3．5 卵胞内游离钙浓度监测

2．3．7 RNA提取

2．3．8 RNA琼脂糖凝胶的配置及RNA电泳

2．3．9 cDNA的反转录

2．3．10 定量PCR检测

2．3．11 活细胞工作站钙离子记录的操作

2．3．12 钙离子振荡参数的计算

2．3．13 数据的统计与分析

第三章 实验结果

3．1 卵龄对小鼠卵母细胞孤雌激活后钙离子振荡模式的影响

3．2 孤雌激活液pH值对小鼠卵母细胞孤雌激活后钙离子振荡的影响

3．3 小鼠卵母细胞不同成熟方式对其孤雌激活后钙离子振荡的影响

3．4 体外成熟的裸卵或卵丘-卵母细胞复合物孤雌激活后钙离子振荡模式的比较

3．5 内质网应激对卵母细胞孤雌激活钙离子振荡的影响

第四章 讨论

4．1 小鼠卵母细胞排卵后的卵龄影响其孤雌激活后钙离子振荡模式

4．2 孤雌激活液的pH值影响卵母细胞孤雌激活钙离子振荡模式

4．3 小鼠卵母细胞成熟方式影响其孤雌激活钙离子振荡模式

4．4 内质网应激影响卵母细胞孤雌激活钙离子振荡模式

第五章 结论

参考文献

附录

攻读学位期间成果

致谢

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