MALAT1诱导高糖刺激下的肾小管上皮细胞发生EMT和损伤及其机制研究

摘要

目的：
　　本研究以体外培养的人肾小管上皮细胞(Human Kidney-2cells，HK-2cells)为研究对象。首先，明确高糖下HK-2中的MALAT1表达升高，其后，探讨MALAT1介导高糖作用下的HK-2细胞发生上皮细胞间充质转分化(EMT)与损伤。最后，探讨MALAT1介导细胞EMT与损伤的通路机制。
　　方法:
　　1.检测高糖刺激下HK-2细胞中MALAT1的表达：将细胞分为正常组、甘露醇组、高糖组，分别刺激12、24、36以及48小时，RT-qPCR法检测MALAT1的mRNA水平;
　　2.MALAT1介导高糖刺激下HK-2细胞发生的EMT与损伤：转染siRNA-MALAT1及negative control siRNA，用免疫印迹法检测EMT标志蛋白E-cadherin、α-SMA的蛋白水平，用RT-qPCR法检测E-cadherin、α-SMA以及肾小管损伤标记因子KIM-1、NGAL的mRNA水平，用ELISA法检测KIM-1、NGAL的蛋白水平;
　　3.MALAT1在HK-2EMT和损伤中的作用机制：转染siRNA后，用免疫印迹法检测β-catenin、c-Myc、cyclin D1的蛋白水平，用细胞免疫荧光方法观察β-catenin的细胞定位;
　　随后，分组分为正常组、甘露醇组、高糖组、LiCl组、HG+DKK-1/DKK-1组，检测细胞EMT、损伤及Wnt/β-catenin标志物的表达;
　　最后，将组别分为高糖+siRNA-MALAT1组、高糖+siRNA-MALAT1+LiCl组、高糖+siRNA-MALAT1+DKK-1组，检测EMT标志物的mRNA、蛋白水平及Wnt/β-catenin标志物的蛋白水平。
　　结果:
　　1.高糖诱发HK-2细胞中的MALAT1表达增加
　　RT-qPCR结果显示：高糖组中MALAT1的表达随时间增加逐渐升高，其中36小时达到高峰，而甘露醇对HK-2的MALAT1的表达几乎无影响。
　　2.MALAT1介导高糖诱发的HK-2细胞的EMT和损伤
　　免疫印迹结果和RT-qPCR结果显示：高糖诱导HK-2的E-cadherin下降，α-SMA升高，在转染siRNA-MALAT1后，该现象被逆转，而转染了negative control siRNA序列的组，两者的表达与高糖组无明显差异;
　　RT-qPCR和ELISA显示：高糖能上调KIM-1和NGAL的蛋白和mRNA水平，甘露醇对该两者无影响。转染siRNA-MALAT1后，该现象被部分逆转，而转染了negative control siRNA序列的组，两者的表达水平与高糖组无统计学差异。
　　3.MALAT1介导HK-2细胞中Wnt/β-catenin信号通路的激活
　　免疫印迹结果显示，高糖与LiCl能上调Cyclin D1，c-Myc，和β-catenin的蛋白水平，而DKK-1能部分逆转高糖的这些影响，甘露醇组对HK-2细胞无此影响;
　　最后转染siRNA-MALAT1后，Cyclin D1，c-Myc，和β-catenin的蛋白水平下调，而转染了negative control siRNA序列和高糖组之间这些蛋白的表达无统计学差异。
　　4.MALAT1通过激活Wnt/β-catenin信号通路介导HK-2细胞的EMT
　　敲除MALAT1后加入LiCl，部分升高的E-Cadherin与部分降低的α-SMA又重新被诱发降低与升高，而加入DKK-1后，部分升高的E-Cadherin与部分降低的α-SMA得到进一步的缓解。
　　5.MALAT1可能不通过激活Wnt/β-catenin信号通路介导HK-2细胞的损伤
　　加入LiCl之后，RT-qPCR和ELISA的结果显示，KIM-1与NGAL的表达相对于正常组有明显的下调趋势，而加入DKK-1之后，其表达与高糖组无明显差异。提示MALAT1升高能诱发肾小管上皮细胞的损伤，而激活Wnt/β-catenin信号通路可能对HK-2的损伤因子有着保护的作用。
　　结论:
　　高糖通过上调MALAT1的表达诱导HK-2细胞发生EMT与损伤，其中发生EMT机制可能与MALAT1异常激活Wnt/β-catenin信号通路有关，但是MALAT1可能并不直接通过激活Wnt/β-catenin信号通路介导HK-2细胞的损伤。

目录

摘要

前言

1．研究背景

2．研究目的

3．研究内容

材料与方法

1．实验材料

2．实验方法与步骤

结果

2．MALAT1介导高糖诱发的HK-2细胞的EMT

3．MALAT1介导高糖诱发的HK-2细胞的损伤

4．MALAT1介导HK-2细胞中Wnt／β-catenin信号通路的激活

5．MALAT1通过激活Wnt／β-catenin信号通路诱导HK-2细胞发生EMT

6．MALAT1不是通过激活Wnt／β-eatenin信号通路诱导HK-2细胞发生损伤，机制未明

讨论

全文结论

参考文献

英文缩略词表

攻读学位期间成果

致谢

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