基于高通量测序技术膀胱过度活动症中尿液菌群失调的研究

摘要

目的：
　　微生物对于人类的健康和疾病至关重要。近年来学者已证实在健康尿液中有常驻的微生物群落存在，多项研究结果提示尿液菌群可能和下尿路症状(lower urinary tract symptoms，LUTS)相关。
　　膀胱过度活动症(Overactive bladder，OAB)是一种常见的膀胱功能障碍，其主要表现为尿急，伴或不伴有急迫性尿失禁，通常伴有尿频和夜尿，而无泌尿系统感染或其他确切病变。OAB症状还能影响心理健康，造成焦虑和抑郁等心理疾患。其发病机制尚未完全明确，总体治疗效果并不满意。因此，亟需开展OAB发病机制和新治疗靶点的研究。
　　本研究旨在探讨OAB患者和正常对照组尿液菌群的差异，寻找OAB潜在的菌属标志物;评定OAB患者焦虑、抑郁状况，同时利用避水应激诱导OAB症状的大鼠模型，研究尿液菌群与心理状态的相关性。
　　方法：
　　1.研究对象
　　纳入2016年8月至2017年5月间在南方医科大学南方医院泌尿外科门诊诊断为OAB的女性患者，对照组来源于体检中心健康志愿者。参与者填写膀胱过度活动症症状评分表(OABSS)、焦虑自评量表(SAS)和抑郁自评量表(SDS)。
　　2.DNA提取、16S rDNA扩增及高通量测序
　　留取患者中段尿标本30-50ml，行总DNA的提取和细菌16S rDNA的V4区扩增，最后于Illumina MiSeq平台进行高通量测序。
　　3.动物实验
　　SPF级雌性Wistar大鼠19只。随机将大鼠分为对照组(n=7)，压力组(n=6)和撤压组(n=6)。
　　避水应激模型建立:使用自制的有机玻璃水池，水池中央有一平台，将压力组与撤压组大鼠放在平台上，池内注水;对照组放入无水的池中，每日1h，连续10天。
　　明暗箱实验:摄像系统分别记录5min内大鼠的穿箱次数和明箱的滞留时间评估大鼠焦虑行为。
　　下腹部痛阈测定:用Von-Frey纤维毛刺激大鼠下腹区域，记录疼痛阈值。
　　排尿印记:将大鼠置于改良的代谢笼中，尿液滴至硫酸铜纸滤纸表面可见的蓝色斑点状印迹，计算5小时排尿频率。
　　膀胱测压:20％乌拉坦腹腔注射麻醉大鼠后，经尿道插入导管至膀胱，连接测压管与膀胱测压系统。生理盐水持续灌注膀胱，记录膀胱压力-容积曲线。
　　留取大鼠尿液行DNA提取扩增及高通量测序。
　　4.生物信息学分析
　　测序原始数据导入QIIME软件，进行质量过滤、操作分类单位(Operational taxonomic units，OTUs)聚类和物种分类注释。基于OTUs的分析结果，进行样品微生物α多样性和β多样性分析。LEfSe鉴别显著差异的菌属。
　　5.统计学方法
　　计量资料采用Mann-Whitney U或t检验，计数资料采用Pearson卡方检验或Fisher精确检验，双变量相关性使用Pearson相关性分析。统计分析应用SPSS21软件，P＜0.05表示差异有统计学意义。
　　结果：
　　1.OAB组与对照组在人口学特征上差异无统计学意义。OAB组在OABSS、SAS和SDS和三个量表的得分均显著高于对照组（P均＜0.01）。40％(12/30)和47％(14/30)OAB患者分别报告有焦虑症和抑郁症，大部分为轻中度。
　　2.OAB组和对照组测序读数和OTUs数差异无统计学意义。稀疏曲线趋于平缓，说明样本测序数据覆盖绝大部分细菌。
　　3.OAB组的chao1和simpson指数均显著低于对照组，提示OAB患者尿液菌群多样性和丰富度降低。主成分分析的三维图显示，对照组和OAB组样本在图中被明显的区分开来。门分类水平上，OAB组尿液中Actinobacteria(19.8％)显著高于对照组(6.8％);Bacteroidetes的相对比例则是对照组(15.7％)显著高于OAB组(8.1％)。科水平上，Enterobacteriaceae和Bifidobacteriales相对含量在OAB尿液中均显著高于对照组。LEfSe提示，属水平上Proteus和Aerococcus等7个菌属相对丰度在OAB组尿液中升高。对照组中，Lactobacillus和Prevotella等13个菌属相对丰度显著升高。
　　4.双变量相关性分析发现，SDS评分与shannon指数和chao1指数均呈负相关。基于LEfSe分析，Burkholderia和Cryocola等6个菌属在非焦虑患者中比例更高;Sneathia和Porphyromonas等7个菌属在焦虑患者中比例更高。与抑郁患者相比，非抑郁患者尿液中有更高比例的Actinobaculum、Pedobacter，WAL1855D和Clostridium菌。
　　5.避水应激诱导大鼠焦虑样行为，撤去应激因素后焦虑样行为得到改善。压力组下腹部痛阈下降值显著大于其余两组。压力组尿频显著多于对照组和撤压组，撤压组与对照组相比则无显著差异。膀胱测压显示，对照组大鼠排尿收缩频次显著低于压力组和撤压组;与压力组相比，撤压组的排尿收缩频次有所降低。
　　6.压力组尿液菌群多样性显著高于其他两组;压力组包含更丰富的菌属，撤压组的菌群结构特征介于其它两组之间。LEfSe法确定三组尿液菌群各水平分类中显著差异的细菌。
　　结论：
　　1.女性OAB患者和对照组的尿液菌群结构上存在显著差异，某些菌属可能是OAB疾病的生物标志物和潜在的治疗靶点。抑郁评分与OAB患者的尿液菌群特征的相关性提示心理状态可能与尿液菌群有关。
　　2.应激处理后大鼠呈焦虑样表现，出现膀胱功能改变和菌群失调;撤去应激因素后，焦虑和膀胱功能得到改善，尿液茵群特征也接近于对照组。这提示焦虑样行为、膀胱功能和尿液菌群三者之间可能存在某种联系。

目录

摘要

前言

第一章 女性OAB患者的尿液菌群结构谱和多样性分析

第一节 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

第二节 结果

2．1 参与者的人口特征和临床症状

2．2 测序数据，Alpha和Beta多样性

2．3 对照组和OAB组中尿液细菌的相对丰度比较

2．4 与OAB相关的特定菌属

2．5 OAB患者的尿液菌群和心理症状

第三节 讨论

3．1 目前已有关于OAB／UUI的尿液茵群的研究

3．2 更高多样性且以乳酸杆菌占优的尿液菌群可能起保护作用

3．3 尿液菌群以及心理精神因素可能造成OAB群体的异质性

3．4 泌尿道微生物群可能是泌尿生殖系统感染和疾病的新模式

3．5 中枢神经系统与尿液微生物群之间的联系需要进一步的研究

第二章 大鼠避水应激模型OAB症状与尿液菌群失调的相关性研究

第一节 实验材料与方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

1．3 生物信息学分析

1．4 统计学方法

第二节 结果

2．1 大鼠明暗箱实验结果

2．2 下腹部痛阈

2．3 排尿情况

2．4 大鼠尿液菌群Alpha多样性分析

2．5 大鼠尿液菌群Beta多样性分析

2．6 三组大鼠尿液各水平分类中显著差异的细菌

第三节 讨论

3．1 避水应激实验能有效复制OAB症状

3．2 泌尿道与胃肠道之间存在器官间交互作用，且与心理因素相关

3．3 泌尿道菌群—膀胱—脑轴的假说

全文小结

参考文献

硕士研究生期间发表论文情况

致谢

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