局部肾素-血管紧张素系统在免疫检查点阻断治疗抵抗中的作用和机制研究

摘要

目的：
　　肿瘤的免疫治疗可以通过恢复和激活机体的免疫系统来控制肿瘤。虽然针对CTLA-4和PD-1的单克隆抗体对多种肿瘤有效，但是只有一部分病人显示持续的反应，在大多数肿瘤中将其作为单一治疗手段将近70％的病人不能产生任何效果。目前研究者们认为有许多机制参与了肿瘤对这种治疗的抵抗，其中肿瘤内免疫抑制性微环境被认为是最重要的因素，它能使肿瘤细胞逃避免疫治疗对肿瘤的杀灭。
　　肾素血管紧张素系统是调节机体血压、电解质和体液稳态的重要的循环内分泌系统，血管紧张素Ⅱ是肾素血管紧张素系统的主要生物活性物质。除了循环系统中的肾素血管紧张素系统，在不同器官中包括肾、心、血管等也发现了局部组织肾素血管紧张素系统。
　　在一项回顾性研究中服用血管紧张素转化酶抑制剂或血管紧张素受体拮抗剂的高血压病人罹患某些肿瘤的风险降低了。此后在动物种植瘤模型和人恶性肿瘤的研究中观察到了肾素血管紧张素系统的失调与疾病不良转归的关系，这证明了局部肾素血管紧张素系统在肿瘤生物学中发挥了重要的作用。我们之前的研究表明局部血管紧张素Ⅱ主要存在于人乳腺癌和鼻咽癌的乏氧区域，在这个乏氧区域里肿瘤细胞通过乏氧-乳酸-糜蛋白酶依赖方式自分泌血管紧张素Ⅱ。
　　以往的研究显示血管紧张素Ⅱ通过引起成纤维细胞和巨噬细胞的浸润和活化来参与多种慢性疾病的进展。成纤维细胞和巨噬细胞也是肿瘤微环境中重要的基质细胞，它们可活化成为肿瘤相关成纤维细胞和肿瘤相关巨噬细胞，这对肿瘤内免疫抑制性微环境的形成具有重要作用。因为局部肾素血管紧张素系统也存在于肿瘤微环境中，那么局部肾素血管紧张素系统是否也参与了成纤维细胞和巨噬细胞的募集和活化以及肿瘤免疫抑制性微环境的形成呢？
　　本研究中我们使用了对免疫检查点阻断治疗抵抗的4T1小鼠乳腺癌细胞和中度敏感的CT26小鼠结肠癌细胞的移植瘤模型，研究表明局部血管紧张素Ⅱ在肿瘤免疫抑制性微环境的形成中有重要作用，阻断血管紧张素Ⅱ信号可以消除肿瘤对免疫检查点阻断治疗的抵抗。
　　方法：
　　1.材料
　　小鼠乳腺癌细胞株4T1和小鼠结肠癌细胞株CT26（中国科学院上海细胞研究所细胞库）;RPMI1640培养基及胎牛血清(Gibco，USA);4-6周龄BALB/c裸鼠（雌性）及正常BALB/c小鼠（雌性）（南方医科大学实验动物中心）;NOD/SCID小鼠（雌性）（北京华阜康生物科技有限公司）;PD-1，CTLA-4单克隆抗体（美国BioXcell）。
　　2.方法
　　2.1.细胞培养
　　小鼠乳腺癌细胞4T1和小鼠结肠癌细胞CT26用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基，于37℃、5％CO2饱和湿度培养箱内培养。
　　2.2.MTT实验检测细胞增殖
　　细胞接种于96孔板中，培养8小时后，加入坎地沙坦、PD123319，坎地沙坦+PD123319均10μM/孔和DMSO继续培养0、24、48、72和96小时后，测定药物对肿瘤细胞的抑制率。
　　2.3.天狼星红染色
　　参照参考文献[30]，福尔马林固定的组织用石蜡包埋，切片厚度为5um。0.1％天狼星红(Direct Red80;Sigma)染色，Weigert's苏木精复染。
　　2.4.流式细胞术
　　流式细胞术数据采用FlowJo7.6软件分析(TreeStar)。死活细胞的鉴别使用Live/Dead Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit(Life Technologies)染色鉴别。所有细胞表面和胞内染色根据抗体说明书的提示操作。
　　2.5.ELISA
　　小鼠血管紧张素Ⅱ、GM-CSF、G-CSF ELISA试剂盒购于美国Ray Biotech公司，依照附带说明书进行实验操作。
　　2.6.免疫荧光
　　肿瘤组织使用OCT包埋剂包埋后在冰冻切片机中进行冰冻切片，切片厚度在4-6um之间，切片完成后行免疫荧光染色。
　　2.7.小鼠细胞因子芯片
　　4T1细胞在常氧和乏氧条件下细胞因子（含308个细胞因子）使用RayBio Mouse Cytokine Antibody Array分析。阳性对照用于标准化待比较的不同的样品的结果，最后计算蛋白质表达的倍数变化。
　　2.8.动物实验
　　四周龄雌性BALB/c小鼠、BALB/c裸小鼠和BALB/c小鼠进行不同动物实验。待皮下移植肿瘤体积长至约200mm3后，对小鼠进行相应处理，并每3天用游标卡尺测量小鼠皮下瘤长短径，记录数据。
　　2.9.统计学分析
　　数据使用SPSS13.0软件进行统计分析，用ELISA法检测AngⅡ、GM-CSF和G-CSF水平，用流式细胞术检测Teffs、Tregs、TAMs、MDSCs比例和Teffs/Tregs比采用t检验(student's t test)。体外细胞增殖、体内肿瘤的生长数据使用双向方差分析(two-way repeated-measures ANOVA)。荷瘤小鼠模型采用Kaplan-Meier生存分析，统计学差异使用Mantal-Cox log-rank检验。统计结果以平均值±标准差（(x)±s）来表示，P值＜0.05视为有统计学差异。
　　结果：
　　1.肿瘤微环境中局部血管紧张素Ⅱ参与了肿瘤细胞的免疫逃逸。
　　2.血管紧张素Ⅱ信号阻断可改善肿瘤免疫检查点阻断治疗的疗效。
　　3.血管紧张素Ⅱ信号阻断逆转了免疫抑制性肿瘤微环境。
　　4.乏氧4T1细胞中抑制AGT表达能使其产生免疫活性细胞因子。
　　5.4T1乳腺癌模型中沉默AGT联合应用PD-1抗体产生了异位效应。
　　结论：
　　局部血管紧张素Ⅱ参与了肿瘤免疫抑制性微环境的形成，介导了肿瘤对免疫检查点阻断治疗的抵抗。血管紧张素Ⅱ信号的阻断或抑制肿瘤细胞AngⅡ的产生可显著增强免疫治疗的效果。联合应用血管紧张素Ⅱ信号阻断剂和免疫检查点抗体是一种具有广阔应用前景的治疗策略。

目录

摘要

前言

1．1 细胞与动物

1．2 主要试剂与耗材

1．3 主要溶液配制

1．4 主要仪器

第二章 实验方法

2．1 细胞培养

2．2 细胞乏氧

2．3 稳定沉默AGT的细胞株的构建

2．5 ELISA法检测上清中血管紧张素Ⅱ、GM-CSF、G-CSF

2．6 小鼠皮下成瘤及体内用药

2．7 肿瘤组织的解剖获取

2．8 肿瘤单细胞悬液制备

2．9 流式细胞术

2．10 石蜡切片标本的制备与免疫组化

2．11 冰冻切片标本的制备和免疫荧光

2．12 天狼星红染色实验

2．13 小鼠细胞因子芯片分析

2．14 统计学分析

2．15 补充材料

第三章 实验结果

3．1 肿瘤微环境中局部血管紧张素Ⅱ参与肿瘤细胞免疫逃逸

3．2 血管紧张素Ⅱ信号阻断改善了肿瘤免疫检查点阻断治疗疗效

3．3 血管紧张素Ⅱ信号阻断逆转了免疫抑制性肿瘤微环境

3．4 乏氧4T1细胞中沉默AGT表达使其产生免疫活性细胞因子

3．5 4T1肿瘤模型中沉默AGT联合应用PD-1抗体产生异位效应

第四章 讨论

第五章 结论

全文小结

参考文献

缩写词简表

致谢

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