亲水基团修饰靶向GPC3受体的新型分子探针的构建及PET显像研究

摘要

磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(Glypican-3，GPC3)是硫酸类肝素蛋白聚糖家族中的一员，特异性的高表达在80％以上的人肝癌组织中，而非肝癌组织不表达。L5(序列为RLNVGGTYFLTTRQ)是韩国学者Lee等经噬菌体展示及转染技术筛选出来的GPC3受体的特异靶向多肽。近几年，研究团队开发了18F标记的L5显像剂用于荷瘤裸鼠HCC成像，然而，肝脏及肠道聚集了大量的放射性显像剂，其图像质量并不是很好，不利于肝脏和腹部肿瘤的显像。为了提高显像效果，在前期研究的基础上，对NOTA-L5进行修饰，在靶向多肽NOTA-L5的-NH2端增加了亲水基团GGGRDN(简称L)，制备了18F标记的18F-AlF-NOTA-L-L5，期望亲水基团的引入能提高探针的水溶性，减少肝胆排泄，降低肝脏和肠道的放射性背景，更有利于肝细胞癌的显像。
　　目的：
　　1.通过将GGGRDN(L)的亲水性基团修饰NOTA-L5多肽并使用18F-AlF螯合法进行放射性标记开发新型的GPC3靶向PET探针(18F-AlF-NOTA-L-L5)。
　　2.与18F-AlF-NOTA-L5进行比较，探索亲水基团L的引入后的靶向探针18F-AlF-NOTA-L-L5能否减少肝胆排泄，降低肝和肠中的背景放射性，提高肿瘤显像效果。
　　方法：
　　1.合成L5、L-L5、NOTA-L5及NOTA-L-L5，并对多肽进行分离纯化及分析鉴定。
　　2.用表面等离子共振(SPR)测量来确定NOTA-L5和NOTA-L-L5对GPC3蛋白的亲和力。
　　3.采用手动和模块化通过18F-AlF螯合法标记得到放射性标记探针18F-AlF-NOTA-L5及18F-AlF-NOTA-L-L5，并测定各自的标记率和放化纯度。
　　4.用HPLC对18F-AlF-NOTA-L5及18F-AlF-NOTA-L-L5放射性药物进行体外稳定性实验，使用γ计数器对上述放射性药物进行体内稳定性实验及脂水分配系数实验。
　　5.体外细胞摄取及流出实验用于评价18F-AlF-NOTA-L5和18F-AlF-NOTA-L-L5与受体GPC3的结合特性。
　　6.建立HepG2及RH7777裸鼠肿瘤模型，经尾静脉注射18F-AlF-NOTA-L5或18F-AlF-NOTA-L-L5，并研究该肿瘤模型的microPET/CT显像及裸鼠的体内分布。
　　7.通过对HepG2及RH7777肿瘤组织行免疫病理检查确认其GPC3表达。
　　结果：
　　1.合成多肽L5、L-L5、NOTA-L5和NOTA-L-L5，纯度均大于95％。质谱分析主峰分子量与理论分子量相符，满足实验要求。
　　2.亲和力实验：用表面等离子体共振(SPR)测定法测定NOTA-L5和NOTA-L-L5与GPC3结合能力，结果显示：NOTA-L5和NOTA-L-L5的解离常数(KD)分别为1.01×10-7和6.33×10-8mol。两者的KD都在纳摩尔级别，提示亲水基团修饰对亲和力无明显影响。
　　3.18F-AlF-NOTA-L5和18F-AlF-NOTA-L-L5合成产率分别为79.98±8.04％和54.81±9.05％，18F-AlF-NOTA-L-L5标记产率低于18F-AlF-NOTA-L5(P＜0.05)。经C18柱纯化后其放化纯度分别为97.17±1.03％和100±0％,两者的放化纯度差异有统计学意义(P＜0.05)。产物峰单一，与未标记前的多肽出峰位置基本相同。
　　4.稳定性试验：18F-AlF-NOTA-L5在37℃PBS及血清中的放化纯度均大于94％，18F-AlF-NOTA-L-L5在37℃PBS及血清中的放化纯度均大于98％，18F-AlF-NOTA-L-L5体外稳定性优于18F-AlF-NOTA-L5(P＜0.05)。在注射18F-AlF-NOTA-L560分钟后，18F-AlF-NOTA-L5及18F-AlF-NOTA-L-L5的体内稳定未见明显差异(P＞0.05)。
　　5.脂水分配实验：经实验测定18F-AlF-NOTA-L5的Log P=-2.10±0.07,18F-AlF-NOTA-L-L5的Log P=-2.42±0.09，两者之间的统计学分析表明18F-AlF-NOTA-L-L5分子探针亲水性比18F-AlF-NOTA-L5好(t=5.482,P=0.002,n=4)。
　　6.体外细胞摄取实验：HepG2细胞摄取18F-AlF-NOTA-L-L5及18F-AlF-NOTA-L5两种示踪剂曲线相似，HepG2细胞摄取18F-AlF-NOTA-L-L5稍高于18F-AlF-NOTA-L5，但是两者差别不大。HepG2细胞摄取18F-AlF-NOTA-L5及18F-AlF-NOTA-L-L5明显高于GPC3阴性的RH7777细胞。HepG2细胞与两种放射性药物共同孵育30min后，HepG2细胞结合放射活性接近高峰，并达到平台期。
　　7.micro PET/CT显像：注射18F-AlF-NOTA-L5或18F-AlF-NOTA-L-L5后，18F-AlF-NOTA-L-L5的HepG2肿瘤摄取显著高于18F-AlF-NOTA-L5(30min：3.10±0.26vs2.28±0.33,t=3.935,P=0.008;60min：3.27±0.34vs1.90±0.65,t=3.757,P=0.016),120min18F-AlF-NOTA-L-L5肿瘤摄取为1.35±0.17％ID/g稍高于18F-AlF-NOTA-L5肿瘤摄取(1.08±0.73％ID/g)，差异没有统计学意义(t=0.730,P=0.493)。注射18F-AlF-NOTA-L-L530min、60min及120min后，不表达GPC3RH7777肿瘤几乎不摄取，HepG2肿瘤摄取在不同时间的均显著高于RH7777肿瘤摄取（30min：3.10±0.26vs1.75±0.04,t=10.308,P=0.002;60min：3.27±0.34vs1.63±0.03,t=9.639,P=0.002;120min：1.35±0.17vs0.66±0.05,t=7.693,P=0.003）。18F-AlF-NOTA-L5在30min、60min、120min肝脏摄取值高于18F-AlF-NOTA-L-L5肝脏摄取值，并且30及60min18F-AlF-NOTA-L-L5肝脏摄取值显著低于18F-AlF-NOTA-L5肝脏摄取，差异具有统计学意义(30min：6.35±2.54vs1.93±0.39,t=3.449,P=0.038;60min：4.32±1.49vs1.85±0.37,t=3.232,P=0.041;120min：2.30±0.21vs1.23±0.43,t=2.118,P=0.079)。18F-AlF-NOTA-L-L5的肾脏摄取值都明显高于18F-AlF-NOTA-L5的肾脏摄取值，差异都具有统计学意义(30min：37.55±3.79vs12.83±1.65,t=6.426，P=0.001;60min：35.9±2.56vs8.70±1.70,t=11.798,P=0.000;120min：31.86±3.8vs2.57±0.17,t=4.224,P=0.006)。
　　8.免疫组化结果显示GPC3在HepG2肿瘤组织高表达，在RH7777肿瘤组织中不表达。
　　结论：
　　1.本研究通过Al18F螯合法成功制备了18F-AlF-NOTA-L5和18F-AlF-NOTA-L-L5，其放化纯达97％以上。此Al18F-NOTA螫合化学方法简便、省时，可通过“一锅法”标记完成，并同时能进行模块式自动化生产，为临床大批量生产提供可能。此实验表明：亲水基团修饰NOTA-L5肽后，18F-AlF-NOTA-L-L5放射性标记效率低于18F-AlF-NOTA-L5放射性标记效率，但是其放化纯度高于18F-AlF-NOTA-L5。
　　2.以上实验证明：增加亲水基团GGGRDN后，不影响18F-AlF-NOTA-L-L5与GPC3结合能力，不影响18F-AlF-NOTA-L-L5体内外稳定性，且其亲水性明显提高。
　　3.体外细胞摄取实验表明18F-AlF-NOTA-L-L5摄取均符合受体-配体竞争结合规律。
　　4.经microPET/CT和体内放射性分布研究证实引入亲水基团后，肿瘤摄取提高了，肝胆排泄明显降低，肾脏摄取明显增高，肿瘤/肝比值明显增高，有利于肝细胞癌的显像。

目录

摘要

第一章 研究背景

1．2 磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(Glypican-3，GPC3)是肝细胞癌的靶向显像和治疗靶点

1．3 A1 18F-NOTA螯合化学方法

第二章 研究材料及相关仪器

2．1 主要仪器及试剂

2．2 细胞系和实验动物

第三章 研究内容及方法

3．1 靶向GPC3受体多肽L5及L-L5的合成

3．2 NOTA-L5及NOTA-L-L5的合成方法学

3．3 亲和力实验

3．4 18F-AlF螯合法标记NOTA-L5及NOTA-L-L5

3．5 脂水分配系数测定

3．6 体外稳定性

3．7 体内稳定性

3．8 细胞培养技术

3．9 18F-AlF-NOTA-L5和18F-AlF-NOTA-L-L5细胞摄取及流出实验

3．10 裸鼠模型的建立及确定

3．11 荷HepG2及RH7777瘤鼠Micro PET／CT显像

3．12 荷HepG2及RH7777瘤鼠体内生物学分布实验

3．13 免疫组化检测GPC3蛋白在肝细胞癌组织中的表达

3．14 异常毒性实验

第四章 统计学分析

第五章 研究结果

5．1 GPC3靶向肽多肽的合成

5．2 NOTA修饰L5及L-L5的合成

5．3 亲和力实验

5．4 18-AIF螯合法标记NOTA-L5及NOTA-L-L5

5．5 脂水分配系数

5．6 体外稳定性

5．7 体内稳定性

5．8 体外细胞摄取及流出实验

5．9 micro PET／CT显像

5．10 免疫组化结果

5．11 异常毒性实验

第六章 讨论

参考文献

中英文缩略语对照表

攻读学位期间成果

致谢

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