肺腺癌患者EGFR和MET酪氨酸激酶抑制剂耐药突变的功能学研究

摘要

背景与目的：表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitors，TKIs）的出现，将EGFR突变肺腺癌患者一线治疗的中位无进展生存期（median progression free survival，mPFS）提高到14个月。但是几乎所有服用EGFR TKIs的患者都会耐药，其中有一半以上的患者出现EGFR基因20号外显子T790M突变。第二代EGFR TKIs阿法替尼(Afatinib)和达可替尼(Dacomitinib)对EGFR敏感突变有更强的抑制作用，但也对获得性T790M突变患者疗效欠佳。第三代EGFR TKIs奥西替尼(Osimertinib)在获得性T790M耐药的患者中取得9.9至12.3个月的mPFS，但是患者对奥西替尼也不可避免地会出现耐药，且机制非常复杂，目前还未完全阐明。
　　MET(mesenchymal to epithelial transition factor)基因扩增或过表达作为一种EGFR TKIs耐药机制的同时，也可以独立发生在肺癌患者中。虽然在MET通路中预测药物疗效的生物标志物还不如EGFR突变那么明确，但已有多种在研MET TKIs。克唑替尼(crizotinib)作为间变性淋巴瘤激酶(Anaplastic lymphoma kinase，ALK)基因重排的抑制剂，已被批准上市，但是其最初的研发目的则是一种MET TKIs，而目前NCCN等指南已将高拷贝数的MET扩增和MET14号外显子跳读突变作为克唑替尼适应症推荐。除此之外，INC280，XL184，BMS777607等多种MET TKIs在临床试验中也已经初见疗效，但目前是对这些MET TKIs的耐药机制却知之甚少。
　　方法：通过二代测序技术在服用MET TKIs以及EGFRTKIs进展耐药的患者中发现了新的突变，并进一步利用慢病毒转染工具细胞在细胞以及动物试验水平了解新发突变的功能以及筛选对该突变可能有效的药物;同时还利用计算机对突变后蛋白结构变化对药物结合的影响进行了分析，探究耐药的原因。
　　结果：本研究第一部分利用二代测序液体活检技术在一例对奥西替尼耐药的临床患者中发现了EGFR基因两种新的第三次突变L792H(c.T2375A)和G796R(c.G2386C)，两突变分别与T790M顺式存在（in cis），但突变之间反式存在（in trans）。为进一步探究两种新突变对奥西替尼疗效的影响，构建了含有L858R/T790M/L792H以及L858R/T790M/G796R突变的慢病毒稳定转染的鼠NIH-3T3细胞以及Ba/F3细胞，验证了两种突变引入后使得细胞对奥西替尼的半数生长抑制浓度(GIso)升高，并对多种药物组合模式均耐药。同时，利用计算机模拟分析证明两种突变对奥西替尼结合EGFR蛋白具有明显的空间位阻影响。
　　本研究的第二部分研究基于课题组前期工作基础，构建了慢病毒稳定转染的鼠MET D1226N和Y1228H NIH-3T3细胞及相应的裸鼠皮下成瘤模型，在细胞和动物实验水平研究了METD1226N和Y1228H突变对多种MET TKIs的疗效影响，药物实验发现两种突变对INC280和crizotinib耐药，但XL184仍可以有效抑制突变细胞和裸鼠瘤体生长，并呈现剂量依赖性抑制效果。
　　结论：我们的研究首次在细胞水平验证了EGFR L792H和G796R突变对第三代EGFR TKIs奥西替尼及多种药物组合均耐药;另外，在细胞和动物水平验证了XL184可以有效克服MET突变D1226N和Y1228H，为临床中出现此类突变的患者提供了有效的治疗方案。

目录

摘要

前言

实验仪器设备与试剂

1 实验所用仪器设备

2 主要试剂

第一部分 EGFR L792H和G796R突变对第三代EGFR酪氨酸激酶抑制剂奥西替尼耐药

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

4 结论

第二部分 XL184克服克唑替尼和INC280耐药突变MET D1226N和Y1228H

1 材料和方法

2 结果

3．讨论

4 结论

全文总结和创新

参考文献

博士在读期间发表论文

大会投稿及发言

致谢

中英文缩写索引

声明