硫酸羟氯喹在氟尿嘧啶诱导的胃肠炎模型中的治疗作用及分子机制

摘要

目的:
　　化疗药物引起的胃肠炎是临床上化疗药物引起的最常见的副作用之一，不仅严重影响化疗药物的治疗效果，而且使接受化疗的肿瘤患者生活质量进一步下降，死亡率明显增加。目前临床上主要以对症支持治疗为主，缺乏针对性的治疗手段。有报道发现，炎症与免疫的激活在化疗药物的抗肿瘤作用的过程中起到至关重要的作用，这个过程有赖于免疫细胞对死亡相关分子模式(danger-associated molecule patterns，DAMPs)的识别。而羟氯喹(hydroxychloroquine，HCQ)因其良好的有效性及安全性被广泛应用于风湿免疫性疾病的治疗，其对免疫系统的影响主要是抑制免疫细胞对DAMPs的识别，以及对多个炎症信号通路传导及促炎因子的产生的抑制作用。因此，本实验以此作为切入点，探究了HCQ在氟尿嘧啶诱导的胃肠炎模型中的作用及其背后的分子机制，为化疗药物引起的胃肠炎提供一个治疗新思路，为临床提供实现化疗药物抗肿瘤治疗优化的选择。
　　方法:
　　实验分为三个部分，前两部分为体内实验，第三部分为体外实验。体内实验中，首先观察了HCQ对氟尿嘧啶诱导的胃肠炎的治疗作用，主要从以下几个方面进行研究:通过建立氟尿嘧啶诱导的胃肠炎模型，观察HCQ治疗前后氟尿嘧啶诱导的胃肠炎小鼠临床症状严重程度的变化，包括体重的变化和腹泻评分;采用H&E染色对HCQ治疗前后小鼠小肠进行组织病理学观察;另外还运用了TUNEL(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated deoxyuridine triphosphate nick end labeling)染色的方法比较了HCQ治疗前后对小鼠小肠上皮细胞死亡的影响;用酶联免疫吸附试验(ELISA)的方法检测了HCQ治疗对模型小鼠血清中细胞因子IL-1β(interleukin-1β)水平的影响。体内实验进一步观察了HCQ调节化疗药物引起的胃肠炎的分子机制。采用免疫荧光染色的方法观察HCQ治疗前后小鼠小肠切片中信号通路的变化情况。体外实验，首先以人结肠癌细胞系HCT-116为研究对象，探索了氟尿嘧啶浓度及刺激时间对细胞上清dsDNA(double-strand DNA)水平之间的关系。之后以小鼠骨髓来源的巨噬细胞与树突状细胞(bone-marrow derived macrophages/dendritic cells，BMDMs/BMDCs)作为研究对象，观察了HCQ干预对dsDNA刺激下BMDMs/BMDCs分子信号通路及炎性因子水平IL-1β的影响。本研究使用IBM SPSS23.0统计软件对实验数据进行统计分析。数据结果用均数±标准差来表示。本实验中两个样本的均数比较采用非配对的t检验，双侧取值;两组以上均数比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，其中组与组之间差异的比较采用LSD检验，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。
　　结果:
　　体内实验结果显示，氟尿嘧啶诱导的胃肠炎模型小鼠血清中dsDNA水平明显升高，HCQ能明显降低模型小鼠胃肠炎的严重程度。与模型组比较，组织病理切片上观察HCQ治疗能明显恢复化疗药物对小鼠小肠细胞及组织结构的破坏;TUNEL染色显示HCQ治疗明显减少模型小鼠小肠上皮细胞的死亡;ELISA结果显示HCQ治疗能明显降低模型小鼠血清中炎症因子IL-1β水平。小鼠小肠组织切片免疫荧光结果显示HCQ减轻化疗药物的胃肠炎是通过抑制TLR9-NF-κB信号通路而实现。
　　体外实验结果显示，氟尿嘧啶与HCT-116细胞上清dsDNA水平之间的关系存在剂量与时间关系，dsDNA浓度均随着氟尿嘧啶浓度的增加及刺激时间的延长逐渐升高。免疫蛋白印迹法检测HCQ预处理抑制BMDMs/BMDCs中TLR9的表达。ELISA结果显示HCQ预处理可降低dsDNA刺激的BMDMs/BMDCs培养上清中IL-1β水平。
　　结论:
　　双链DNA是化疗药物诱导的胃肠炎发生发展中的关键因素，是炎症与免疫系统活化的始动因素。HCQ可通过抑制机体炎症细胞TLR9对dsDNA的识别，进一步抑制其下游核转录因子NF-κB，从而抑制炎症而发挥作用，减轻了疾病的严重程度。在临床中HCQ治疗化疗药物引起的胃肠道毒性，以及从炎症的识别与发生的角度作为切入点在化疗药物引起的胃肠道毒性尚无报道。本研究通过研究HCQ在化疗药物诱导的胃肠炎中的治疗作用，为临床提供了一个新的治疗选择，并帮助实现化疗药物抗肿瘤治疗的优化。

目录

摘要

前言

第一章 HCQ减轻氟尿嘧啶诱导的胃肠炎的严重程度

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二章 HCQ对诱导的胃肠炎模型小鼠小肠细胞信号通路的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第三章 HCQ对体外免疫细胞信号通路的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

全文小结

参考文献

中英文缩写词表

致谢

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