基于时间分辨荧光免疫层析快速定量检测降钙素原(PCT)试剂的研究

摘要

感染性疾病是临床上的常见病，发病率呈逐渐上升的趋势，严重的感染患者会发生感染性休克。不同类型的感染性疾病的治疗方案也不同，细菌感染需要及时采用抗生素进行治疗，非细菌性感染则应慎用抗生素治疗。脓毒血症是一种死亡率较高的疾病，是非心脏内科ICU病人死亡的主要原因，我国估计约300万例/年，死亡率40％-50％。不能接受有效的抗生素治疗，患者的死亡风险逐渐上升，每推迟一小时，死亡率将增加7.6％。因此对这些感染性疾病进行早期的鉴别诊断，选择合适的治疗方案显得非常重要。降钙素原(procalcitonin，PCT)作为脓毒血症、炎症的一个良好血清学标志物，有助于临床感染性疾病的鉴别诊断及其预后评估，指导抗生素使用。目前PCT的检测方法主要有定量法（化学发光法、酶联免疫发光分析法）和半定量法（胶体金法）。化学发光法、酶联免疫发光分析法能准确定量，化学发光法需要大型专用仪器、费用昂贵、使用不便，酶联免疫发光分析法操作繁琐，准确性影响因素较多等缺点，限制了使用范围。胶体金法快速简便，但是不能精确的定量。PCT的动态监测和早期检测在临床上的价值意义重大，因此需要建立一种能快速、简便、准确对PCT定量的方法。
　　目的:
　　建立一种适用于床旁检测(Point of care testing，POCT)又称为“即时检验”的快速定量检测方法以助于PCT的及时检测和动态监测。本研究采用时间分辨结合免疫层析技术，建立一种快速定量检测PCT的方法。
　　方法:
　　1.将购买的两对PCT特异性单克隆行标记和包被抗体配对组合，用时间分辨免疫荧光分析法(TRFIA，Time-resolved fluoroimmunoassay)进行筛选，获取最佳的标记及包被抗体。
　　2.应用双抗体夹心法，建立基于时间分辨荧光免疫层析快速定量检测降钙素原(PCT)试剂的方法。对各项试剂参数进行优化包括:硝酸纤维膜（NC膜）的筛选、检测线(T)和质控线(C)包被抗体量、最佳的划线量、标记抗体最佳用量、最佳反应时间确定。
　　3.对试剂性能指标评估，进行以下实验:标准曲线、分析灵敏度、准确度、精密度、特异性、临床考核实验。
　　结果:
　　1.通过TRFIA法，综合剂量-反应曲线相关系数(r)、信噪比、背景等，筛选最优的标记原料(M J03);包被原料(16B5)。
　　2.确立基于免疫层析技术与时间分辨技术反应模式;最佳的硝酸纤维膜HF135膜;检测线(T)16B5最佳包被用量2.0mg/mL;质控线(C)山羊抗兔IgG最佳包被用量1.0mg/mL;最优划线喷速0.08μL/mm;标记抗体MJG03最佳用量为0.1mg/mL;兔IgG最佳用量为0.1mg/mL;最佳反应时间为15min。
　　3.试剂性能指标评估:标准曲线回归方程:log(y)=1.1143+0.8529log(x)，r=0.9994;分析灵敏度为0.08ng/mL;准确度（回收率）在93％～105％之间;分析、分析间精密度CV在5.4％～13.4％;检测样本时不受人降钙素、CRP、人抗钙素、IL-6干扰物质的影响;234例临床样本考核实验等效性对比研究表明，自制试剂盒和商品化试剂盒(Roche Elecsys BRAHMS PCT Kit)具有很好的一致性(Kappa=0.875)和相关性[r=0.977，(P＜0.01)]。
　　结论:
　　本研究成功研制了基于时间分辨荧光免疫层析技术快速定量检测PCT的试剂，试剂各项参数、性能指标良好，均符合体外诊断试剂的要求。能很好的满足临床对PCT快速定量检测的需求。

目录

摘要

前言

第一章 快速定量检测降钙素原(PCT)试剂反应模式的建立和原料的筛选

1．1 材料

1．2 方法

1．3 结果与讨论

第二章 基于时间分辨荧光免疫层析快速定量检测降钙素原(PCT)试剂方法学建立

2．1 材料

2．2 方法

2．3 结果与讨论

第三章 基于时间分辨荧光免疫层析快速定量检测降钙素原(PCT)试剂实验室分析性能及临床初步应用评价

3．1 材料

3．2 方法

3．3 结果与讨论

结论

参考文献

中英文缩略词对照

硕士期间科研成果

致谢

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