HER4--YAP1轴通过诱导HER2阳性胃癌细胞上皮间质转化促进曲妥珠单抗的耐药

摘要

目的: 胃癌(gastric cancer)是我国最常见的消化道恶性肿瘤，胃癌患者确诊时80％已处于进展期，手术和化疗对进展期患者整体生存改善的作用并不明显[1]。ToGA研究显示，在治疗HER2阳性胃癌中曲妥珠单抗联合其他化疗药物可以使患者中位生存时间较曲妥珠单抗单独治疗由11.8月上升至16.0月[2，3]。然而，在治疗HER2阳性胃癌中，多数患者用药一年内就出现了耐药[4]。 肿瘤侵袭转移指肿瘤细胞脱离原发部位转移到不连续的靶组织继续增殖生长的过程[5]。EMT通过改变肿瘤细胞的特性及生存微环境增强肿瘤的侵袭转移性[6]。研究表明，EMT与化疗抵抗和耐药存在共同的信号调控途径[7，8]。EMT可使肿瘤细胞对化疗药物的敏感性也发生显著的变化[9-12]。在多种耐药细胞株的构建过程中，细胞的形态均发生间质性改变，也提示了EMT在细胞耐药过程中的重要角色[13]。 HER4是由前期全外显子测序检测胃癌腹膜转移灶而筛选出的突变，提示其可能和EMT的发生密切相关[14]。HER4的表达降低可增强HER2阳性乳腺癌对曲妥珠单抗的治疗反应，然而，尚无研究报道HER4的表达与激活如何调控其对曲妥珠单抗的反应[15,16]。而HER4是否可以调控HER2阳性胃癌的EMT发生从而诱导曲妥珠单抗的耐药目前尚无证据。 人源性肿瘤组织异种移植(patient derived xenograft，PDX)是将来自患者的组织经免疫缺陷小鼠的体内培养，最终获得的新型肿瘤模型[17]。PDX模型正是深入研究胃癌个体化治疗及抗肿瘤药物筛选的可靠模型[18,19]。 本课题拟结合PDX模型及分子生物学方法，获得HER4参与HER2阳性胃癌曲妥珠单抗耐药的可靠证据并阐明其分子机制，为确立HER4作为克服胃癌曲妥珠单抗耐药提供充分的临床前依据。 方法: 1.通过浓度梯度诱导法构建HER2阳性胃癌细胞单抗耐药细胞株并利用Western blot、免疫组化、免疫荧光检测耐药前后与EMT相关指标间的关系; 2.通过裸鼠尾静脉注射实验和皮下成瘤实验验证耐药前后细胞在体内的定植及增值能力的变化; 3.通过瞬时转染耐药细胞株HER4-siRNA，研究HER4对耐药细胞侵袭迁移能力变化的影戏及在EMT发生的过程中的作用; 4.建立siHER4稳定敲低表达的耐药细胞株，体内验证其增殖、定植能力; 5.利用生物信息学方法筛选出HER4下游靶基因YAP1并利用Western blot、Q-PCR、免疫荧光、CoIP等验证其相互作用关系。 6.利用siRNA干扰技术瞬时敲低YAP1后，通过免疫荧光、Transwell、划痕、Western blot的方法验证YAP1在诱导耐药细胞株侵袭迁移、EMT等的能力; 7.通过Transwell实验、免疫荧光实验及流式检测AnnexinⅤ标记的细胞凋亡、Western blot的方法检测NRG1诱导耐药株EMT的能力及抑制凋亡的能力; 8.建立PDX耐药模型，并通过Western blot、免疫组化验证各指标在耐药前后的变化。 结果: 1.HER2阳性胃癌细胞耐药后发生了典型的EMT现象且侵袭转移的能力明显增强; 2.HER4在HER2阳性胃癌细胞曲妥珠单抗耐药的过程中表达水平显著上调，在诱导耐药株EMT的发生，PI3K信号通路的激活起着重要作用; 3.HER4通过调控下游YAP1的表达诱导耐药细胞株侵袭转移及凋亡的能力; 4.HER4-YAP1-EMT轴在HER2阳性胃癌曲妥珠单抗耐药PDX模型中通过激活PI3K信号通路诱导其耐药。

目录

摘要

前言

一、HER4与肿瘤关系研究进展

二、上皮细胞-间充质转化(EMT)与肿瘤耐药的关系

三、PDX耐药模型的构建及应用

第一章HER2阳性胃癌细胞株曲妥珠单抗耐药细胞株的构建及侵袭迁移能力的变化

一、材料及方法

二、结果

三、结论

四、讨论

第二章HER4-YAP1-EMT轴在HER2阳性胃癌细胞株曲妥珠单抗耐药过程中发挥着至关重要的作用

一、材料和方法

二、结果

三、结论

四、讨论

第三章HER2阳性胃癌PDX耐药模型的构建及验证

一、材料与方法

二、结果

三、结论

四、讨论

全文小结

参考文献

攻读博士学位期间成果

致谢

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