基于NS5为靶点的DENV新型抑制剂的发现及机制研究

摘要

登革病毒是登革病毒感染疾病的病原体，属黄病毒科黄病毒属，是一种具有包膜的单股正链RNA病毒，通过虫媒叮咬传播。登革病毒感染一般会引起轻微的自限性的登革热和严重致命的重症登革。据估计，全球范围内每年约有5000万到1亿登革热感染病例，50万例登革出血热，其中25000人不治而亡。近年来，登革热病例正在迅猛增加，这种致命的传染病已威胁到全球三分之一人口的健康安全。预防、治疗和媒介控制是对付登革病毒感染的主要措施，然而目前临床上缺乏安全有效特异性治疗登革病毒感染性疾病的药物，因此急需开发有治疗潜能的抗病毒药物。登革病毒NS5是一个参与病毒RNA基因组复制的关键酶。N端甲基转移酶结构域负责RNA5'加帽，C端RdRp结构域具有RNA从头合成活性，两者在病毒RNA复制中发挥必不可少的作用。
　　研究目的：
　　分别以登革病毒NS5N端2'O甲基转移酶和C端RNA依赖的RNA聚合酶为靶点筛选化合物以获得结构新颖的非核苷类先导化合物，为开发安全有效的抗登革病毒药物提供新的指引。
　　研究方法：
　　(1)抗登革病毒活性检测：空斑实验检测化合物对感染细胞释放子代病毒滴度的抑制效果;细胞病变抑制实验和乳酸脱氢酶释放量测定以感染细胞为对象考察化合物对感染细胞的保护作用;qPCR检测化合物对病毒RNA合成的抑制效果;Western blot实验和免疫荧光实验检测化合物对病毒蛋白合成的抑制效果。(2)抗登革病毒活性的化合物靶点探索：计算机辅助的分子对接检测化合物与NS52O'甲基转移酶的亲和效果;原核表达NS5RdRp通过SPR检测化合物与RdRp的结合作用;免疫荧光法检测NS5的基因组产物dsRNA，qPCR检测化合物对病毒RNA合成的抑制效果，Time of Drug Addition实验验证化合物抑制NS5蛋白合成病毒基因组的活性。
　　研究结果：
　　Z1与DENV2NS5RdRp具有较强亲和力，而Diasarone-Ⅰ能与NS52'O甲基转移酶相互结合。Z1和Diasarone-Ⅰ具有较好的登革病毒抑制活性，半数有效浓度(EC50)分别为是4.75，3.90μM。Z1和Diasarone-Ⅰ浓度依赖抑制病毒RNA合成，干扰病毒复制中间体dsRNA合成，且都在病毒早期复制阶段发挥活性效果。Z1和Diasarone-Ⅰ浓度依赖抑制病毒结构蛋白和非结构蛋白合成，并限制感染的扩散。
　　研究结论：
　　二氢吡咯烷酮类小分子化合物Z1靶向登革病毒NS5C端RNA聚合酶，抑制病毒RNA的从头合成从而具有抗病毒活性。来源于传统中药石菖蒲根茎水提取物的Diasarone-Ⅰ作用于登革病毒NS5N端2O'甲基转移酶，同样抑制病毒RNA基因组的合成，两者都是拥有良好发展前景的抗登革病毒先导化合物。

目录

摘要

前言

第1章 登革病毒NS5 RdRp的表达与纯化

1 材料

2 实验方法

3 实验结果

4 小结与讨论

第2章 RNA聚合酶小分子抑制剂Z1抑制登革病毒复制和感染的研究

1 材料

2 实验方法

3 实验结果

4 小结与讨论

第3章 2’O甲基转移酶抑制剂双细辛酮-Ⅰ抑制登革病毒复制和感染的研究

1 材料

2 实验方法

3 实验结果

4 小结与讨论

全文结论

讨论和展望

参考文献

缩写词中英文对照表

成果

致谢

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