Sirt3转染BMSC优化的β-磷酸三钙仿生骨支架的构建及成骨能力研究

摘要

目的:
　　因创伤、感染、肿瘤等疾病造成的骨缺损，面临庞大的临床修复需求。组织工程骨作为一种新型骨修复材料，受到了广泛的关注，但实际应用还存在两大难题:一是从自体提取的骨髓间充质干细胞增殖、分化效率低，难以用作组织工程的种子细胞;二是骨组织工程支架提倡模仿天然骨组织的形态结构，但目前尚无公认的模仿天然骨组织的仿生支架结构。本研究设计、制备三种不同结构的仿生支架，并通过体外生物相容性检测进行筛选。为提高增殖能力，本研究通过Sirt3转染骨髓间充质干细胞，提高细胞的氧化磷酸化水平，从而促进细胞的增殖与分化。进而将细胞/支架复合体植入大鼠颅骨缺损部位，评价体内成骨能力。旨在提供适宜体外细胞富集的仿生支架模型，并构建具有快速增殖分化能力的骨组织工程种子细胞株，为利用组织工程方法进行骨缺损修复提供新的思路和方法。
　　方法:
　　(1)利用参数化建模设计仿生支架的三维模型。通过水热法制备β-磷酸三钙(β-TCP)粉体并利用3D打印制备该仿生支架和0°/90°结构网格支架，通过磷酸二氢铵二次煅烧法制备天然松质骨结构支架。进行红外光谱、X射线衍射分析三种支架的理化性能表征，进行Micro-CT扫描重建、扫描电镜、压缩实验分析三种支架的结构表征。
　　(2)分离、培养SD大鼠骨髓间充质干细胞，通过Giemsa染色、流式细胞术鉴定细胞后进行细胞/支架共培养，活/死细胞染色、DNA含量检测评价细胞在三种支架上增殖和粘附的效果，更换成骨诱导培养基后进行碱性磷酸酶活性和RT-PCR检测成骨相关基因表达检测，探究三种支架结构对细胞增殖、粘附、成骨分化的影响，综合实验指标选取体外生物相容性最优的一种支架结构。
　　(3)构建pcDNA3.1-Sirt3真核表达载体，将Sirt3基因转染到SD大鼠骨髓间充质干细胞，并利用荧光显微镜、Western Blot检测蛋白表达，用相应试剂盒检测细胞耗氧量、ATP生成量、关键代谢酶活性上的变化。将细胞附着在仿生支架上，分别利用MTT法和RT-PCR检测细胞增殖和成骨相关基因表达水平的变化。
　　(4)手术构建了SD大鼠颅骨6.0mm直径圆形缺损动物模型，分别植入成骨诱导后，复合了Sirt3转染骨髓间充质干细胞和正常骨髓间充质干细胞的β-磷酸三钙仿生支架。于植入后4周、8周分别进行Micro-CT扫描重建和免疫组织化学染色，评价体内骨修复效果。
　　结果:
　　水热法制备的粉体与煅烧法处理的牛股骨余物经检测同为β-磷酸三钙。3D打印制备的仿生支架具有较高的压缩模量、孔隙率和表面积。同时仿生支架上接种SD大鼠骨髓间充质干细胞表现出了良好的体外生物相容性。通过脂质体介导转染SD大鼠骨髓间充质细胞稳定表达Sirt3基因，转染后细胞的氧消耗增加，ATP生成增多，相关代谢酶活力旺盛，细胞增殖、分化速率显著提高。将Sirt3转染骨髓间充质干细胞/β-磷酸三钙仿生支架复合物植入SD大鼠颅骨缺损区域8周后，Micro-CT和免疫组化结果显示有明显新骨组织生成。
　　结论:
　　通过三维建模设计和3D打印制备的仿生支架具有良好的细胞相容性。Sirt3转染骨髓间充质干细胞使细胞氧化磷酸化水平显著提高，促进了细胞的增殖和分化。Sirt3转染骨髓间充质干细胞/β-磷酸三钙仿生支架复合物在体内植入后骨再生效果良好。本研究构建的新型仿生支架结构有望作为组织工程支架模版用于骨缺损修复，同时Sirt3基因有望用于构建快速增殖分化的自体骨髓间充质干细胞株，作为组织工程的种子细胞。

目录

摘要

第一章 前言

1．1 骨组织工程用于骨缺损修复

1．2 骨髓间充质干细胞

1．3 成骨诱导分化

1．4 Sirt3基因对氧化磷酸化的调控

1．5 基因转染骨髓间充质干细胞用于组织工程

1．6 组织工程仿生支架

1．7 3D打印技术用于制备组织工程支架

1．8 研究内容及创新点

第二章 松质骨仿生支架的设计制备及检测

2．1 引言

2．2 实验材料

2．3 松质骨仿生支架三维建模

2．4 水热法制备β-磷酸三钙粉体与初步表征检测

2．5 3D打印制备支架

2．6 磷酸二氢铵法煅烧牛松质骨骨块

2．7 材料表征检测

2．8 支架结构检测

2．9 实验结果与讨论

2．10小结

第三章 仿生支架的体外生物相容性检测

3．1 引言

3．2 实验刺料

3．3 大鼠骨髓间充质干胞分离、培养、鉴定

3．4 细胞／支架共培养及细胞粘附检测

3．5 成骨诱导分化及检测

3．6 统计学方法

3．7 实验结果与讨论

3．8 小结

第四章 Sirt3转染骨髓间充质干细胞的构建及细胞增殖、分化检测

4．1 引言

4．2 实验材料

4．3 Sirt3目的基因的获取、扩增与纯化

4．4 目的片段和克隆载体的体外重组

4．5 感受态大肠杆菌DH5α的制备与重组质粒转化

4．6 重组质粒的提取与鉴定

4．7 骨髓间充质干细胞的转染

2．10 小结

4．9 细胞呼吸代谢水平检测

4．10 细胞增殖检测

4．11 细胞度架共培养及细胞粘附检测

4．12 成骨诱导分化

4．13 成骨相关基因表达水平检测

4．14 统计学方法

4．15 实验结果及讨论

4．16 小结

5．1 引言

5．2 实验材料

5．3 动物实验分组及造模

5．4 颅骨缺损修复动物实验

5．6 组织学及免疫组化染色分析

5．7 实验结果与讨论

5．8 小结

第六章 本文总结与展望

参考文献

附录

中英文缩略词表

致谢

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