间充质干细胞来源的外泌体对人滋养细胞系HTR8/Svneo迁移的影响的相关研究

摘要

胎盘是胎儿与母体之间物质交换的重要器官，胎儿在子宫中发育依靠胎盘从母体取得营养，胎盘还合成多种激素、酶和细胞因子等，以维持正常妊娠。胎盘的形成是胚胎正常发育的基础，在功能性胎盘发育过程中，滋养细胞的迁移与侵袭有着重要作用，其过程受到机体严格的凋节。研究表明滋养层细胞的过度迁移和侵袭在早期流产、妊娠期高血压疾病(hypertensive disorder complicating pregnancy，HDCP)以及胎儿内发育迟缓等妊娠期疾病的发生发展中具有重要作用。而滋养细胞迁移和侵袭的调节机制目前尚不清楚，因此研究其分子机制可以为妊娠期疾病的诊疗提供新的思路。
　　外泌体(exosomes，EXOs)是一种可以通过多种途径介导细胞之间物质及信息传导的微型囊泡，通过胞吐作用从细胞内分泌到细胞外环境，并稳定存在于细胞外环境。不同细胞来源的外泌体内成分差异较大，因此其被认为是重要的局部微环境调控介质，并在妊娠期参与多种妊娠生理过程。目前研究发现，母体循环中存在胎盘来源的外泌体，调控母体全身器官妊娠期的功能改变，以适应妊娠的需求，若这一调控过程发生异常，则会引起妊娠疾病的发生。
　　间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)是来源于中胚层发育早期阶段的具有强大自我修复及多向分化潜能的成体干细胞，最早发现于骨髓中，随后在脂肪、脐带、肌肉、肝脏等多种组织器官的间质中也被发现。有研究表明，子宫存在大量间充质干细胞，子宫内的间充质干细胞可以分泌大量细胞因子，在内膜血管生成中发挥着重要作用，且子宫间充质干细胞功能异常与子痫前期的发生密切相关。间充质干细胞能够通过旁分泌生成有效生物学活性物质一外泌体，进而参与包括组织损伤修复、血管生成、促进肿瘤微环境构建等多种病理生理过程。近期研究发现，肿瘤产生的外泌体可释放一系列的细胞因子、生长因子、黏附分子和细胞外基质蛋白，介导肿瘤微环境和肿瘤细胞一细胞的交流。髓来源间充质干细胞源性外泌体可以促进肿瘤细胞的迁移与侵袭，增强肿瘤血管生成等，如肝癌细胞、结肠癌细胞和黑色素瘤细胞产生的外泌体都可以促进相应肿瘤的侵袭。
　　在胎盘形成过程中，胚胎滋养层细胞侵入到母体蜕膜及其中的螺旋动脉，通过替代血管内皮细胞重铸子宫螺旋动脉，建立母体、胎儿之间的交互式循环，为胚胎的发育提供营养，其细胞迁移及侵袭与肿瘤侵袭性质相似。目前间充质干细胞来源的外泌体在滋养细胞迁移中的相关性及调控机制尚未见研究报道，因此，进一步探索间充质干细胞来源的外泌体与滋养细胞迁移的相关性，对揭示其在妊娠期疾病诊疗中的潜在作用具有重要的临床意义。
　　目的：
　　本研究将初步探讨间充质干细胞来源的外泌体与滋养细胞迁移的相关性，从而进一步揭示其在妊娠相关疾病中的发病机制。
　　方法：
　　1.采用超高速离心的方法，从间充质干细胞C3H10T1/2的培养基中提取外泌体，并再次离心纯化。
　　2.通过透射电镜、Nanosight分析外泌体的大小、形态。
　　3.通过SDS-PAGE电泳及Western blot检测并鉴定外泌体表面标志物-ALIX+TSG101的表达水平。
　　4.利用PKH26实验证实外泌体与滋养细胞HTR8/Svneo相融合情况。
　　5.通过细胞迁移实验探讨不同浓度(25ug/ml、50ug/ml)间充质干细胞来源的外泌体对HTR8/Svneo细胞迁移的影响。
　　6.通过RT-PCR检测与外泌体相融合的滋养细胞HTR8/Svneo中与细胞迁移相关基因MMP-2的表达。
　　结果：
　　1.通过透射电镜、Nanosight对超高速离心法获得的间充质干细胞上清液沉淀物观察发现：沉淀物呈圆形，大小为40-100nm;Western blot进一步证实其表达外泌体特异性标志物-ALIX、TSG101。
　　2.滋养细胞HTR8/Svneo能够摄取间充质干细胞来源的外泌体，摄入反应6h、12h相比较，24h表现出较高摄入量。
　　3.Transwell实验表明间充质干细胞来源的外泌体可以显著促进滋养细胞的迁移，且浓度越高，迁移越显著。
　　4.摄入间充质干细胞来源的外泌体之后，滋养细胞HTRS/Svneo MMP2基因的表达显著上调，且与其浓度相关。
　　结论：
　　间充质干细胞来源的外泌体能够显著促进滋养细胞HTR8/Svneo的迁移，其作用机制可能是通过上调HTR8/Svneo MMP2基因的表达而引起的。

目录

摘要

前言

第一部分 间充质干细胞来源外泌体的分离与鉴定

1、实验材料

2、实验方法

3、实验结果

4、讨论

5、小结

第二部分 间充质干细胞来源外泌体对滋养细胞系HTR8／Svneo迁移的影响

1、实验材料

2、实验方法

3、实验过程

4、统计学分析

5、实验结果

6．讨论

全文小结

参考文献

综述 外泌体在子痫前期发病机制中的研究现状

中英文缩略词

致谢

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