表观遗传调控在三氯乙烯致肝细胞毒性中的作用机制

摘要

目的：三氯乙烯（trichloroethylene，TCE）是一种广泛应用于工业生产中的有机溶剂，同时也是一种常见的环境污染物，TCE职业暴露和环境暴露引起的健康问题成为了人们普遍关注的公共卫生问题。TCE中毒常伴随着不同程度的肝损伤，然而，TCE致肝脏损伤具体的分子机制尚未清楚。课题组前期研究发现TCE可诱导肝细胞SET表达上调，并证实了SET是TCE致肝细胞毒性的关键蛋白。大量研究表明，SET与表观遗传调控有着密切的联系，但是SET如何在TCE致肝细胞毒性中起作用，特别是涉及TCE与SET之间的表观遗传调控机制仍有待进一步研究。在课题组前期研究中筛选出TCE作用下肝细胞中表达下调、可能靶向调控SET的miRNA候选分子miR-21a，miR-199b-5p。此外还发现，TCE处理可诱导L-02肝细胞发生DNA损伤，DNA损伤修复蛋白p53表达上调，进一步研究表明，SET蛋白可在一定程度上抑制p53的表达。利用蛋白质组学研究发现SET可介导组蛋白H3K79二甲基化(H3K79me2)修饰水平降低。在此基础上，本研究深入探索了SET上下游的表观遗传调控机制及其在TCE致肝细胞毒性中的作用。本研究主要分成以下两个方面内容：
　　研究内容1：miRNA调控SET在TCE致肝细胞毒性中的作用
　　方法：在前期筛选肝细胞中可能靶向作用于SET的miRNA(miR-21a，miR-199b-5p)的基础上，双荧光素酶报告系统检测miR-21a，miR-199b-5p与SET之间的靶向调控关系;进一步利用Western blot检测miRNA高表达与稳定干扰L-02肝细胞中SET的变化。流式细胞术分析TCE处理后正常L-02肝细胞、miRNA稳定高表达及稳定干扰的肝细胞凋亡的变化。
　　结果：双荧光素酶报告基因和Western blot检测结果表明miR-199b-5p可以与SET-3'UTR结合，从而部分抑制SET表达。细胞流式检测结果表明，TCE处理后，与正常L-02肝细胞比较，miR-199b-5p低表达时凋亡率明显升高，提示miR-199b-5p可以在一定程度上缓解TCE诱导的肝细胞凋亡。
　　结论：L-02细胞中miR-199b-5p可以与SET-3'UTR结合，从而部分抑制SET表达，在一定程度上缓解TCE诱导的肝细胞凋亡。
　　研究内容2：SET通过介导H3K79me2调控p53在TCE致肝细胞DNA损伤中的作用
　　方法：以L-02细胞与SET缺陷L-02细胞为受试细胞，0mmol/L、8mmol/LTCE处理24h后，通过染色质免疫共沉淀结合荧光定量PCR技术(CHIP-qPCR)检测DNA损伤修复基因p53启动子区域H3K79me2修饰水平。通过siRNA靶向抑制肝细胞中H3K79特异性甲基转移酶Dot1L，进一步分析H3K79me2对p53的表观遗传调控作用以及p53在TCE致肝细胞DNA损伤修复中发挥的关键作用。
　　结果：前期研究显示，TCE致肝细胞毒性作用中，SET能部分抑制p53表达。本研究发现，TCE作用下，L-02肝细胞与SET缺陷L-02肝细胞中p53启动子区域组蛋白H3K79me2修饰水平上调。通过抑制肝细胞中H3K79甲基化转移酶Dot1L后发现，H3K79me2修饰水平下调时，p53表达也降低。彗星实验结果表明，当p53表达被抑制时，TCE诱导的L-02肝细胞DNA损伤加重。
　　结论：SET通过介导p53启动子区域H3K79me2降低，部分抑制DNA损伤修复蛋白p53的表达，而p53表达下调在一定程度上会加剧TCE致肝细胞DNA损伤。

目录

摘要

第一章 引言

1．1 TCE毒性

1．1．1 TCE代谢

1．1．2 TCE的毒作用研究

1．2 SET蛋白

1．3 表观遗传学研究

1．4 本课题组前期研究基础

1．5 本课题研究目的及意义

1．6 研究内容

1．6．1 miRNA对SET靶向调控机制及其在TCE致肝细胞凋亡中的作用

1．6．2 SET通过介导H3K79me2调控p53在TCE致肝细胞DNA损伤中的作用

第二章 miRNA对SET的调控机制及其在TCE致肝细胞毒性中的作用

2．1 前言

2．2 实验材料

2．2．1 细胞株及受试物

2．2．2 主要试剂

2．2．3 主要仪器

2．3 实验方法

2．3．1 细胞培养基和溶液配置

2．3．2 细胞培养与TCE处理

2．3．3 双荧光素酶报告系统实验

2．3．4 Western blot检测

2．3．5 细胞凋亡检测

2．3．6 数据统计分析

2．4 实验结果

2．4．1 miR-199b-5p通过结合SET-3’UTR抑制SET表达

2．4．2 miR-199b-5p在TCE致肝细胞凋亡中的作用

2．5 讨论

2．6 本章小结

第三章 SET通过介导H3K79me2调控p53在TCE致肝细胞DNA损伤中的作用

3．1 前言

3．2 实验材料

3．2．1 细胞株与染毒物质

3．2．2 主要试剂

3．2．3 主要仪器

3．2．4 溶液配置

3．3 实验方法

3．3．1 细胞培养与TCE染毒处理

3．3．2 染色质免疫共沉淀

3．3．3 脂质体转染

3．3．4 Western blot

3．3．5 构建p53缺陷L-02细胞

3．3．6 单细胞凝胶电泳

3．3．7 数据统计分析

3．4 实验结果

3．4．1 染色质免疫共沉淀条件

3．4．2 p53基因启动子区H3K79me2修饰水平

3．4．3 组蛋白修饰H3K79me2对p53的表观遗传调控作用

3．4．4 成功构建p53缺陷L-02细胞

3．4．5 p53表达降低对TCE致肝细胞DNA损伤的影响

3．5 讨论

3．6 本章小结

第四章 结论与展望

4．1 结论

4．2 展望

参考文献

附录

攻读硕士学位期间取得的成果

致谢

声明