SARS-CoV实验灭活疫苗免疫效果评价及体外抗SARS-CoV药物研究

摘要

目的：评价SARS-CoV实验灭活疫苗在小动物(兔)体内的免疫效力和安全性,制备高效价兔抗SARS-CoV血清,以及寻找有效的抗SARS-CoV药物。
　　方法：将灭活SARS-CoV全病毒配伍弗氏佐剂免疫SPF级新西兰兔。免疫后,每隔一周耳静脉取血,分离血清,间接ELISA法检测血清中特异性IgG抗体,病毒中和试验检测血清中和抗体,蛋白芯片检测SARS-CoV不同重组蛋白抗原(S1、S2、S3、S4、N、M、3CL)结合抗血清能力；HE染色检测免疫后兔部分组织的病理变化；辛酸-硫酸铵盐析及DEAE离子交换层析分离、纯化兔抗血清。与此同时,开展植物药体外抗病毒活性筛选。
　　结果：SARS-CoV实验灭活疫苗免疫后,兔体内能快速产生特异性IgG抗体和中和抗体,且产生的抗体能在体内维持较长时间；抗体水平呈现规律性变化,IgG抗体效价和中和抗体效价最高分别可达1：25600和1：2560以上。但是全病毒不同蛋白抗原引起的抗体水平有所差别,S2蛋白最强。免疫后,兔肺组织出现病毒间质性肺炎病理变化,与SARS患者肺部病理变化相似,其它组织没有明显的病理变化。兔抗血清经分离、纯化后,得到纯度达90%以上的特异性IgG抗体,活性损失较少。体外抗病毒活性筛选出千金藤素和美国葡萄柚种子提取物都具有良好的抗SARS冠状病毒活性,其治疗作用的IC50分别为6.00μg/mL和1：50000。
　　结论：血清学试验和病理学试验为SARS灭活疫苗进入灵长类动物及临床试验提供技术支持并储备物质基础；体外药效学试验为抗病毒药物的开发提供方向指导和理论依据。这两方面的研究成果对我们最终战胜SARS等病毒性疾病具有重大的意义。

目录

摘要

Abstract

英文缩略词

第一章 前言

一、 SARS概述

二、 SARS及SARS冠状病毒研究现状

1 、 病原体的寻找

2 、 SARS冠状病毒的发现

3 、 冠状病毒的一般特征

4 、 SARS冠状病毒的基因组

5 、 SARS冠状病毒基因编码的蛋白及功能

6 、 SARS冠状病毒的进化

7 、 SARS冠状病毒的物理化学性质

8 、 防治SARS的药物研究与开发

9 、 SARS疫苗的研究与开发

三、 本研究的目的和意义

第二章 SARS-CoV实验灭活疫苗免疫兔及其免疫原性研究

一、 实验材料

1 、 病毒株和细胞株

2 、 实验动物

3 、 主要试剂及仪器

4 、 主要溶液的配制

二、 实验方法

1 、 病毒培养与灭活

2 、 免疫抗原制备

3 、 动物免疫

4 、 兔血清的分离

5 、 IgG抗体检测

6 、 中和实验

7 、 蛋白芯片检测

8 、 病理学检测

三、 结果

1 、 病毒灭活

2 、 兔抗血清中IgG的动力学变化

3 、 兔抗血清中和抗体效价的变化

4 、 蛋白芯片检测兔抗血清成分及变化

5 、 病理切片观察

四、 讨论

第三章 抗SARS冠状病毒兔血清的纯化与鉴定

一、 实验材料

1 、 抗SARS冠状病毒兔血清

2 、 主要试剂和仪器

3 、 主要溶液的配制

二、 实验方法

1 、 辛酸-硫酸铵盐析

2 、 DEAE离子交换层析

3 、 样品的鉴定

三、 结果

1 、 DEAE离子交换层析

2 、 SDS-PAGE电泳

3 、 Western blot

4 、 ELISA检测

5 、 病毒中和试验

四、 讨论

第四章 抗SARS冠状病毒药物研究

一、 实验材料

1 、 药物

2 、 病毒株及其敏感细胞

3 、 主要试剂和仪器

4 、 主要溶液的配制

二、 实验方法

1 、 Vero E6细胞的培养和增殖

2 、 SARS-CoV的增殖

3 、 病毒滴度测定

4 、 药物的细胞毒性测定

5 、 药物的抗病毒活性筛选

三、 结果

1 、 病毒毒力

2 、 药物对Vero E6的细胞毒性

3 、 药物抗SARS-CoV作用

四、 讨论

参考文献

在学期间发表的论文

致谢