光动力学疗法净化异基因活化T细胞预防aGVHD的实验研究

摘要

目的：
　　建立Rhodamine123(Rh123)介导的光动力学疗法,观察光动力学疗法对小鼠及人淋巴细胞增殖、活化功能的影响；对小鼠骨髓造血干祖细胞集落形成的影响；探讨光动力学疗法在选择性灭活对宿主抗原特异反应的人活化T淋巴细胞时,保留静息T细胞对新的第三抗原的反应活性的特性；观察光动力学疗法在小鼠异基因骨髓移植中预防急性移植物抗宿主病(aGVHD)的作用,探讨光动力学疗法调控预防aGVHD的可行性及安全性。
　　方法：
　　1 光动力学疗法实验条件的建立：选择氩离子激光器(波长514 nm)。取BALB/c小鼠脾单个核细胞(MNC),经丝裂霉素灭活作为刺激细胞,C57BL/6小鼠脾MNC作为反应细胞, 37℃、5%CO2培养箱混合淋巴细胞培养72 h,做如下四种处理：(1)加入Rh123(50 nmol/L),分组孵育不同时间,流式细胞仪检测不同时间点细胞对Rh123荧光摄取率及平均荧光强度；(2)混合淋巴细胞加入不同浓度Rh123(终浓度分别为10 nmol/L-60 nmol/L),MTT法测A570；(3)混合淋巴细胞接受不同剂量的激光照射(功率密度10 mW/cm2-60 mW/cm2,分组照射3 min或4 min),MTT法测A570；(4)混合淋巴细胞先加Rh123(50 nmol/L),再接受激光照射(功率密度10 mW/cm2-60 mW/cm2,照射3 min或4 min),继续培养24 h,MTT法测A570。博士学位论文：光动力学疗法净化异基因活化T细胞预防aGVHD的实验研究摘要2光动力学疗法对小鼠骨髓造血干祖细胞集落形成的影响：取c57BL/6小鼠骨髓MNC,加灿123(30 runol/L、40 nrnol/L、50 nrnol/L、60 nmol几)孵育,接受激光照射(功率密度分别为10 mw/cmZ、20 mw/emZ、30 mw/emZ、50mw/c mZ),37℃、5%c02培养箱培养14d。多功能倒置显微镜下观察,计数粒巨噬细胞集落形成单位(CFU一GM)集落。3光动力学疗法对小鼠T淋巴细胞早期活化指标CD69+表达的影响：小鼠混合淋巴细胞培养24h,加灿1 23(50 nmol几)、激光30 mwzemZ照射3 min。流式细胞仪检测CD3+CD69+阳性表达率。4光动力学疗法对宿主抗原特异反应人淋巴细胞的选择性灭活：取健康人A、B、C来源的三份外周血MNC,A、C作为刺激细胞预先经丝裂霉素灭活,B作为反应细胞；按刺激细胞刀反应细胞B(S瓜)比例1：1混合,于%孔板,37oC、5%COZ培养箱培养72h；取出细胞,加Rhl23孵育(50nmol/L) 40min,分别接受激光不同功率密度(10 mwzemZ、30 mw/emZ、50 mw/e时)照射3 min；将经以上光动力学处理的混合细胞再做如下2种处理：(l)再加入刺激细胞A： 2)再加入刺激细胞C,继续培养24h；MTI,法测A570。5小鼠异基因骨髓移植急性移植物抗宿主病(aGvHD)模型建立：以BALB/cH一Zd为受鼠,C57B/6H一b为供鼠。预处理方案为全身照射(TBI),“oCo,8, 0 oy,剂量率：0.7513。oy/min。BALB/。“一Zd受鼠照射后6h经尾静脉注射C57B/6H一Zb供鼠骨髓(总数4x一06)+e57a/6H‘Zb供鼠脾脏淋巴细胞(总数4 x 106)。设注射生理盐水组、同基因骨髓移植组、异基因骨髓移植组为对照。6光动力学疗法预防aGVHD的小鼠移植实验：将c57B/6H一2b供鼠骨髓(4丫106)与经过光动力学处理的混合淋巴细胞(总数4.0x106)混合,移植给BALB/cH一2d受鼠。观察移植后小鼠aGvHD发生及存活情况。取小鼠的肝、脾、肺、皮肤、肠、骨髓组织,制片,HE染色,观察病理。结果1建立光动力学疗法实验条件：(1)以氢离子激光器(波长514tun)为光源,肋123为光敏剂；(2)灿123孵育浓度为50nmol/L；(3)助123孵育时间为40min,博士学位论文：光动力学疗法净化异墓因活化T细胞预防aGvHD的实验研究摘要 4)激光照射功率密度为30 mw/cmZ；(5)激光照射时间为3min。2小鼠骨髓造血干祖细胞集落形成：单纯Rh 123及单纯激光照射对cFU一GM集落形成的影响无显著差异。光动力学组中,30 mw/c mZ以下照射剂量对cFu一GM集落无明显影响；50 mw/c mZ以上照射剂量明显抑制CFU一GM集落形成。3光动力学疗法对小鼠T淋巴细胞早期活化指标CD69+表达的影响：光动力学处理后,混合淋巴细胞培养体系的 CD3+CD69+表达明显下降(P<；0.05)。4光动力学疗法对宿主抗原特异反应的人淋巴细胞的选择性灭活：将经过光动力学处理后的混合淋巴细胞分组,分别加入第一次混合培养时的同一宿主刺激细胞A或另加入一新的外来异基因刺激细胞C；分别再继续培养24h,当激光功率密度为30mw/c mZ时,光动力学处理细胞+原宿主刺激细胞A组的A570值明显低于光动力学处理后细胞+新刺激细胞C组(P<；0.05)。5光动力学疗法预防小鼠异基因骨髓移植中aGVHD的实验：生理盐水组小鼠均于15d内死亡。同基因骨髓+同基因脾脏淋巴细胞移植组100%存活,异基因骨髓+异基因脾脏淋巴细胞移植组(aGVHD组)自第1 ld开始出现典型的aGVHD表现,在22d内死亡。光动力学治疗组也不同程度出现以上aGVHD表现,但临床表现及病理程度减轻,且存活小鼠数量增多,aGVHD组和光动力学组间生存率有显著差异(P<；0.05)。结论u建立光动力学疗法实验条件：(l)以氢离子激光器为光源,Rh123为光敏剂；(2) Rhl23孵育浓度为50 tunol几；(3)Rhl23孵育时间为40 min,(4)激光照射 功率密度为30 mw/emZ；(5)激光照射时I’ed？

目录

缩略词

摘要

前言

第一部分 Rhodamine123介导的光动力学疗法实验条件的建立

材料和方法

结果

讨论

第二部分 Rhodamine123介导的光动力学疗法对异基因活化T淋巴细胞的净化作用

材料和方法

结果

讨论

第三部分 Rhodamine123介导的光动力学疗法预防小鼠急性移植物抗宿主病的实验研究

材料和方法

结果

讨论

论文总结与展望

参考文献

在学期间发表文章

致谢