重组人卵透明带ZP3蛋白在毕赤酵母中的表达和纯化

摘要

透明带(ZP)是哺乳类动物卵细胞膜外包被的一层特殊的非细胞结构,是精子与卵细胞识别和结合的部位。人卵透明带蛋白ZP3是精卵识别和结合过程中的初级精子受体,因而成为研究孕前型避孕疫苗的潜在靶抗原。体内自身透明带抗体的存在会导致卵巢功能紊乱、不孕以及流产等病变。透明带诱发精子顶体反应率还可作为精子功能评价指标。随着基因工程技术的发展,为了得到大量高纯度的透明带抗原进行深入的抗生育疫苗和免疫不孕诊断研究的需要,国内外科研人员都纷纷通过基因工程途径生产透明带蛋白,并克隆了多种哺乳动物卵透明带的cDNA,包括人ZP3的cDNA。利用基因重组的方法可在体外较大量生产人卵透明带ZP3蛋白,为抗生育研究和不育症的诊断提供可靠且成本低廉的研究蛋白。
　　本实验根据人ZP3蛋白编码第23~第408位氨基酸的cDNA序列,设计一对引物,正向引物含6个组氨酸基因序列和EcoR Ⅰ酶切位点,反向引物含Not Ⅰ酶切位点；然后进行PCR扩增。扩增产物和载体质粒pPIC9K各自经EcoR Ⅰ和Not Ⅰ双酶切后,用T4 DNA连接酶连接起来,然后导入大肠杆菌DH5α；在含氨苄青霉素的LB板上挑取单菌落,用煮沸法快速鉴定阳性转化子,并用双酶切和测序方法鉴定质粒。抽提大量重组质粒；将重组质粒线性化后电打孔导入毕赤酵母细胞,在组氨酸缺陷的MD板上筛选阳性克隆。然后用不同浓度的G418-YPD培养液筛选目的基因多拷贝插入的酵母转化子。再通过小瓶培养,SDS-PAGE和Western blotting鉴定选出高表达的的转化菌株。将此菌株在发酵罐里扩大培养,从培养液上清里用亲和层析的办法分离纯化人卵透明带ZP3蛋白。
　　PCR扩增的目的基因片段能重组到载体pPIC9K中,用PCR法快速鉴定阳性克隆,也证实目的基因片段正确插入了载体,测序结果进一步证实人卵透明带ZP3蛋白基因成功克隆进了表达载体。重组质粒转入毕赤酵母后,筛选出多拷贝插入宿主染色体的单克隆,经诱导培养,以及SDS-PAGE和Western blotting分析,有一表观分子量为32~43KD的组分能与兔抗猪ZP3蛋白抗血清发生免疫反应。用镍螯合亲和层析柱能分离这一组分。实验结果表明重组人卵透明带ZP3蛋白在巴氏毕赤酵母细胞中获得成功表达。

目录

1 前言

1.1 透明带概述

1.1.1 卵透明带的结构

1.1.2 卵透明带的生理功能

1.2 卵透明带在生育研究中的作用

1.2.1 抗生育研究

1.2.2 病理研究

1.3 本研究课题的立论依据

1.4 本研究的目的和意义

1.5 本研究的技术路线

2 实验仪器、材料和试剂

2.1 主要仪器

2.2 材料

2.3 试剂

3 实验方法

3.1 构建重组基因表达质粒

3.1.1 PCR扩增目的基因片段--人卵透明带ZP3蛋白基因片段

3.1.2 载体pPIC9K的制备

3.1.3 扩增片段和载体的双酶切

3.1.4 外源基因与载体的连接

3.1.5 氯化钙法制备大肠杆菌DH5α感受态细胞

3.1.6 大肠杆菌DH5α的转化

3.1.7 转化子的检测和鉴定

3.2 重组外源基因在毕赤酵母(Pichia pastoris)中的表达

3.2.1 酵母细胞的转化

3.2.2 阳性克隆的筛选与表达蛋白的鉴定

3.2.3 培养条件的优化

3.2.4 发酵罐高密度培养转化子

3.2.5 亲和层析纯化目的蛋白及其反应原性分析

4 实验结果

4.1 目的基因片段的PCR扩增结果

4.2 重组质粒的构建及鉴定结果

4.3 重组质粒的序列测定结果

4.4 嗜甲醇酵母的转化结果

4.5 阳性克隆的鉴定结果

4.6 多拷贝插入转化子的筛选

4.7 目的蛋白的鉴定结果

4.8 培养条件优化结果

4.8.1 甲醇浓度优化结果

4.8.2 培养液的pH值优化结果

4.9 发酵罐高密度培养转化子

4.10 目的蛋白的纯化及反应原性分析

5 讨论和小结

5.1 酵母表达系统表达人卵透明带ZP3蛋白的优缺点

5.2 重组质粒的构建结果分析

5.3 酵母细胞转化和高拷贝高表达转化子的筛选分析

5.4 目的基因在酵母细胞中的表达及纯化分析

小结

参考文献

论文发表情况

致谢

附录一 各种试剂配制方法

附录二 重组质粒测序结果