生长因子及MAPK途径对生长板软骨细胞增殖和分化的影响

摘要

本文研究了生长因子及MAPK途径对生长板软骨细胞增殖和分化的影响。 第一章大鼠肋生长板软骨细胞的分离、培养及生物学特性的研究。目的：建立大鼠肋生长板软骨细胞的体外培养模型，探讨其在体外培养条件下的生物学特性。 方法：显微解剖分离出大鼠肋生长板，酶消化法(0.05％透明质酸酶和0.2％Ⅱ型胶原酶)获得分散的大鼠肋生长板软骨细胞(ratcostochondralgrowthplatechondrocyte，RGC)，常规接种，单层培养。对原代～第5代RGC进行生长动力学分析，并通过免疫细胞化学、阿尔新兰染色和Westernblot检测原代～第5代RGC中Ⅱ型胶原、α-SMA和蛋白多糖的分布和表达。 结果：原代培养的生长板软骨细胞中95％以上的细胞Ⅱ型胶原阳性染色，细胞核周围和细胞膜周边都有Ⅱ型胶原的阳性染色，阳性染色的纤维包裹着细胞核，保持圆形的细胞强阳性染色。随着传代次数的增加，表达Ⅱ型胶原的细胞比例和表达量下降，第6代RGC中仅保持圆形的细胞仍呈阳性染色。原代培养的RGC表达大量的蛋白多糖，阿尔新兰阳性染色。第2，3代阿尔新兰染色减少，3代后阿尔新兰染色皆呈阴性。原代RGC中，α-SMA的表达很弱，随传代次数增加，α-SMA的表达量逐渐增高；Ⅱ型胶原的表达刚好和α-SMA相反，原代RGC表达最强，随着传代次数的增加，表达逐渐下降。 结论：成功建立大鼠肋生长板软骨细胞的体外培养模型。单层培养的RGC在第4代后逐渐失去分化表型，α-SMA可以作为RGC去分化的一个新的标志物。 第二章生长因子及其组合对RGC增殖和分化的影响。目的：检测生长因子及其组合对传代培养RGC增殖和胶原合成的影响，并探讨连续传代引起的去分化对其作用的影响，为最终建立RGC的无血清培养体系奠定实验基础。 方法：以传代培养的RGC作为实验的模型，通过3H-TdR、3H-Proline和35S-Sulfate掺入的方法检测L-AA、bFGF、IGF-Ⅰ、TGF-β1、TGF-β3、EGF以及它们的组合对无血清培养的原代～第4代RGC增殖、胶原和蛋白多糖合成的影响，RT-PCR检测生长因子及其组合对RGCaggrecan和collagenⅡmRNA转录的影响。 结果：对于原代培养RGC，25μg/mL，50μg/mLL-AA促进10％FBS培养RGC的增殖和胶原合成，但强烈地抑制无血清培养RGC的增殖和胶原合成，因此以下的实验中培养基中均未添加L-AA；本实验所检测的5种生长因子均具有不同程度促进原代RGC增殖和胶原合成的作用，其中bFGF的促增殖能力最强，是无血清对照组的6倍左右，高于10％FBS；TGF-β1促进胶原合成能力最强，是对照组的1.5倍左右，低于10％FBS。10μg/LbFGF、10μg/LIGF-Ⅰ和1μg/LTGF-β1组合的促增殖、胶原和蛋白多糖合成的作用相当或接近于10％FBS的作用。生长因子及其组合对RGC增殖和胶原合成的促进作用随着传代次数的增加均呈下降的趋势。 结论：bFGF、IGF-Ⅰ、TGF-β1、TGF-β3和EGF均可不同程度地促进原代RGC的增殖和胶原合成，生长因子的组合(10μg/LbFGF，10μg/LIGF-Ⅰ和1μg/LTGF-β1)对RGC增殖、胶原和蛋白多糖合成的促进作用相当或接近于10％FBS的作用，可以替代血清实现RGC的无血清培养。生长因子和生长因子的组合对RGC增殖和胶原合成的促进作用随着RGC的去分化呈下降趋势。 第三章MAPK途径与RGC的增殖和分化。目的：探讨MAPK的三条主要途径ERK1/2，JNK和p38在RGC增殖、分化和sox9表达中的作用，以及它们与生长因子及其组合促进RGC增殖和分化作用之间的关系。 方法：通过3H-TdR和3H-Proline掺入法分别检测ERK1/2、JNK和p38的特异性抑制剂PD98059，SP600125、SB203580和酪氨酸蛋白激酶的非特异性抑制剂genistein对原代RGC增殖和胶原合成的影响；Westernblot检验上述抑制剂和生长因子及其组合对RGC中ERK1/2、JNK、p38和sox9表达的影响，RT-PCR检测PD98059对bFGF促collagen和AggrecanmRNA转录的影响。 结果：在所检测的3种特异性抑制剂中，PD98059和SP600125显著抑制原代培养RGC的增殖和胶原合成，SB203580对RGC的增殖和胶原合成没有显著的影响，Westernblot结果证实这3种抑制剂对RGC中磷酸化ERK1/2，JNK和p38表达的抑制作用；Genistein强烈抑制RGC的增殖和胶原合成并改变了RGC的形态，抑制作用高于PD98059和SP600125，Westernblot显示Genistein显著抑制磷酸化ERK、JNK和p38表达。bFGF增加了RGC中磷酸化ERK的表达，IGF-1对磷酸化ERK的表达无影响，但两者的组合对RGC磷酸化ERK表达的促进作用高于bFGF单独的作用。生长因子及其组合对磷酸化JNK的表达无显著影响。RT-PCR的结果表明，PD98059抑制了bFGF的促进collagen和aggrecanmRNA转录的作用。PD98059、SP600125和Genistein均可抑制原代RGC中sox9的表达，并呈浓度依赖性，抑制作用依次是Genistein＞PD98059＞SP600125。 结论：本研究的结果表明MAPK的3条主要途径中，ERK和JNK是控制RGC增殖和胶原合成的主要途径，而p38MAPK途径对RGC增殖没有影响，对胶原合成的影响较弱，ERK和JNK信号途径参与调节sox9的表达，ERK信号途径介导了bFGF促进RGC增殖和胶原合成的作用。 第四章ERK-2腺病毒载体的构建及其对原代RGC增殖和胶原合成的影响。目的：构建表达ERK-2的复制缺陷型腺病毒，并研究Ad-ERK2的感染对原代RGC增殖和胶原合成的影响。 方法：利用细菌内重组的方法构建Ad-ERK2和Ad-CMV的复制缺陷型腺病毒载体，通过荧光显微镜、Westernblot和FACS对构建的载体的包装进行观察、鉴定和滴度测定。通过荧光显微镜和FACS检测腺病毒的感染效率，同位素掺入和FACS检测Ad-ERK2的感染对原代RGC增殖、胶原合成和细胞周期的影响。 结果：构建Ad-ERK2和Ad-CMV腺病毒载体，MOI为100的Ad-CMV感染原代RGC的效率达98.11％。与Ad-CMV相比，Ad-ERK2促进原代RGC的增殖和胶原合成，分别是Ad-CMV空载体组的1.52倍和1.16倍，周期分析显示，Ad-ERK2的使RGC中G2M期和S期的细胞比率增加。 结论：成功构建Ad-ERK和Ad-CMV腺病毒载体。通过表达ERK2的腺病毒载体感染RGC，证明ERK途径参与RGC的增殖和分化。

目录

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引言

软骨和软骨细胞

生长因子与软骨细胞的增殖和分化

软骨细胞增殖和分化过程中的MAPK途径

软骨基因治疗

本研究的目的、内容和意义

参考文献

第一章：大鼠肋生长板软骨细胞的分离、培养及生物学特性的研究

1材料与方法

2结果

2.1RGC的分离、培养及细胞形态的变化

2.2培养RGC的生长动力学分析

2.3 Ⅱ型胶原和α-SMA免疫细胞化学检测的结果

2.4蛋白多糖的检测结果

2.5 α-SMA和Ⅱ型胶原的western blot结果

3讨论

4结论

参考文献

附图1

附图2

第二章：生长因子及其组合对RGC增殖和分化的影响

1材料与方法

2结果

2.1L-AA对培养RGC增殖和胶原合成的影响

2.2 bFGF对RGC增殖和胶原合成的影响

2.3 IGF-Ⅰ对RGC增殖和胶原合成的影响

2.4 TGF-β1对RGC增殖和胶原合成的影响

2.5 TGF-β3对RGC增殖和胶原合成的影响

2.6 EGF对无血清培养RGC增殖和胶原合成的影响

2.7 bFGF、IGF-1、TGF-β 1和TGF-β 3的组合对无血清培养RGC 59增殖和胶原合成的影响

2.8比较生长因子和生长因子的组合对原代培养RGC增殖、胶原和蛋白多糖合成的影响

3讨论

4结论

参考文献

附图

第三章：MAPK途径与RGC的增殖和分化

1材料与方法

2结果

2.1 PD98059对原代培养RGC增殖和胶原合成的影响

2.2 SP600125对原代培养RGC增殖和胶原合成的影响

2.3 SB203580对原代培养RGC增殖和胶原合成的影响

2.4 Genistein抑制RGC增殖和胶原的合成

2.5生长因子和生长因子的组合对原代RGC磷酸化ERK和JNK表达91的影响

2.6 PD98059、抑制Bfgf进原代RGC Aggrecan和Gollagen Ⅱ mRNA转录的作用

2.7 PD98059、SP600125和Genistein抑制原代RGC sox9的表达

3.讨论

结论

参考文献

附图

第四章Erk-2腺病毒载体的构建和原代RGC的感染

第一部分Erk-2腺病毒载体的构建

1.材料与方法

2.结果

3.讨论

4.结论

参考文献

附图

第二部分Ad-ERK2对原代RGC增殖和胶原合成的影响

1.材料与方法

2.结果

3.讨论

4.结论

参考文献

附图

总结

sox基因家族与软骨细胞分化

在学期间发表论文

致谢