半乳糖受体介导c-myc反义核酸对肝癌细胞的靶向增效作用

摘要

本文探讨了半乳糖(Gal)受体介导的c-myc反义核酸(ASODN)对肝癌细胞的靶向投递作用和对肝癌细胞增殖的高效抑制作用。 方法：1细胞培养：人肝癌Bel-7402细胞，Raji淋巴瘤细胞，U937淋巴瘤细胞，培养体系：RPMI-1640培养液含10％新生牛血清，100u/mL青霉素、100ug/mL链霉素，置37℃、5％C02培养箱培养。 2反义核酸的合成、Gal-PEI-ASODN复合物的制备、离体靶向投递实验：(1)c-mycASODN的合成：针对c-myc基因序列162～179设计ASODN并进行全程硫代修饰，3'端羧基荧光素FAM修饰或不修饰(上海生物工程公司合成)，序列为：5'-CTTCTCGAGGCAGGAGGG-3'，(2)半乳糖-聚乙烯亚胺(polyethyleneimine，PEI)-c-myc反义核酸复合物(Gal-PEI-ASODN复合物)制备：采用无血清RPMI-1640液分别溶解Gal-PEI试剂和c-mycASODN，2：1(v/v)混匀，使两者氮磷比为5.0，得Gal-PEI-ASODN复合物。(3)离体靶向投递实验：取Bel-7402细胞、U937细胞或Raji细胞，加入荧光标记的ASODN、Gal-PEI-ASODN，孵育不同时间，流式细胞仪检测细胞荧光摄取率及胞内平均荧光强度的差异，相差/荧光显微镜观察荧光标记物进入3种细胞的形态，台盼蓝拒染法检测Gal-PEI-ASODN复合物对3种细胞增殖抑制作用的差异。 3台盼蓝拒染法、细胞克隆和流式细胞术检测细胞增殖、细胞周期和坏死：取Bel-7402细胞，加入不同浓度的Gal-PEI试剂，ASODN，Gal-PEI-ASODN，孵育不同时间，台盼蓝拒染法检测药物对细胞增殖的抑制作用，计算药物对细胞增殖的IC50；倒置显微镜下计数细胞克隆，并计算克隆形成率；荧光显微镜观察荧光标记的反义核酸进入细胞形态；流式细胞仪检测细胞周期的改变(碘化丙锭染色)，计算细胞增殖指数；流式细胞仪检测凋亡和坏死细胞的百分率(Annexinv-FITC和碘化丙锭双染色)。 4改良MTT法检测肝癌细胞的药物敏感性：药物与Bel-7402细胞作用48h，采用改良MTT法(细胞计数试剂)检测：化疗药物组，化疗药物联合0.25μmol/LGal-PEI-ASODN组，化疗药物联合0.25μmol/LASODN组对细胞增殖的抑制作用，计算各组药物对细胞增殖的IC50和增敏倍数，计算联合用药的效果(作用拮抗、作用相加、作用协同)。化疗药物分别选用三氧化二砷(As2O3)、5-氟尿嘧啶(5-Fu)、表阿霉素(PHA)。 5动物实验(1)建立小鼠HepA细胞肝癌模型：取小鼠肝癌腹水型种鼠，抽取腹水细胞，调1×107cells/mL，吸取0.2mL细胞悬液，对小鼠腹腔注射(种鼠)或右前肢腋下注射(实验鼠)。(2)Gal-PEI-ASODN治疗肝癌移植瘤小鼠：取昆明种小鼠，分空白对照组，Gal-PEI组，ASODN组，Gal-PEI-ASODN组，右前肢腋下接种肿瘤细胞，接种后第1，3，5，7，9天瘤体内注射药物，共5次。第13天脱颈椎处死小鼠，剥离肿瘤，量取瘤重，计算抑瘤率。采用免疫组化SP法检测石蜡切片的c-MYC蛋白的表达情况。 结论：1Gal-PEI-ASODN对Bel-7402细胞具有靶向投递作用，而对U937细胞、Raji细胞无靶向投递作用。 2Gal-PEI-ASODN对Bel-7402细胞增殖具有高效抑制作用，半乳糖受体介导的反义核酸的作用效果提高72倍；Gal-PEI-ASODN对细胞克隆形成均有明显抑制作用；并发现荧光标记的反义核酸在肝癌细胞的细胞表面、胞浆、胞核部位均有分布；Gal-PEI-ASODN抑制Bel-7402细胞增殖的机制可能是能抑制细胞从Go/G1期向S期的转变、对肝癌细胞具有致坏死作用。 30.25μmol/LGal-PEI-ASODN提高了Bel-7402细胞对As2O3，5-Fu，PHA的敏感性，分别提高3.11，1.58，1.96倍。 4Gal-PEI-ASODN能抑制小鼠肝癌移植瘤的生长，抑制肝癌细胞c-MYC蛋白的表达。

目录

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前言

研究假设

引言

一、基因治疗的载体研究进展

二、受体介导的基因投递

三、肝癌反义核酸治

参考文献

第一部分 半乳糖受体介导的c-myc反义核酸对肝癌细胞的靶向投递作用

结果

讨论

参考文献

第二部分半乳糖受体介导的c-myc反义核酸对Bel-7402细胞增殖的高效抑制作用

材料和方法

结果

1 不同时间的Cal-PEI-ASODN对Bel-7402细胞增殖的影响

2 不同浓度的ASODN对Bel-7402细胞增殖的影响

3 不同浓度的Cal-PEI-ASODN对Bel-7402细胞增殖的影响

4 Cal-PEI-ASODN对Bel-7402细胞增殖克隆形成的影响

4 荧光标记的Cal-PEI-ASODN进入Bel-7402细胞的形态

5 Cal-PEI-ASODN对Bel-7402细胞周期的影响

5 流式细胞仪检测细胞凋亡及环死

讨论

参考文献

第三部分半乳糖受体介导的c-myc反义核酸提高肝癌细胞化疗药物敏感性

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第四部分半乳糖受体介导的c-myc反义核酸对小鼠肝癌移植瘤生长的影响

材料与方法

结果

讨论

参考文献

全文结论

尚待探讨的问题

缩略词

在学期间发表论文

致谢