IGF-ⅡP3启动子调控腺病毒介导HSV-tk/GCV系统治疗肝癌实验研究

摘要

肝细胞癌(Hepatocellularcarcinoma，HCC)是世界上第三大致死性肿瘤，每年死亡率超过50万人。至确诊时起，肝细胞癌患者的平均中位生存期小于12个月，且预后不佳。仅有10﹪～20﹪的HCC病人适于手术切除，其5年存活率也仅有10﹪～20﹪，大部分病人病情恶化迅速。由于许多晚期肝细胞癌病人缺乏有效的治疗手段，目前许多学者将兴趣转移到基因治疗上来。通过使用各种载体以瘤内或者血管内注射的方法，治疗基因可以转移到肿瘤部位，甚至远处组织。然而，肿瘤基因治疗同样面临一个特殊问题即转基因特异性表达于肿瘤部位问题，靶向性基因转导依然是目前基因治疗的一大障碍。转录靶向性利用一些肿瘤过表达某些特定基因，所以使用此基因特异性启动子可以驱动治疗基因达到靶向性治疗目的。 人胰岛素样生长因子Ⅱ(InsulinLikeGrowthFactorⅡ，IGF-Ⅱ)定位于染色体11p15.5，其基因长约30kb，内含9个外显子和4个启动子。在机体生长发育过程中，4个不同的启动子调控IGF-Ⅱ基因的转录产生6种不同的mRNA。肝脏发育过程中，IGF-Ⅱ基因的4个启动子(P1-P4)以动态方式进行调节。P3启动子在胎儿肝脏细胞中是活化的，随着分娩其活性受到抑制，在许多人类原发性肝脏肿瘤中再活化。P3启动子的再活化导致IGF-Ⅱ的持续表达是细胞增殖以致形成肝脏肿瘤的一个重要驱动因素。这些研究表明P3启动子驱动IGF-Ⅱ的转录以自分泌和旁分泌的形式刺激肿瘤的形成。因此，IGF-ⅡP3启动子的调控序列可以是靶向性肝细胞癌基因治疗有效靶点，因为其可以特异性作用于IGF-Ⅱ表达的肝癌细胞。 该实验中构建IGF-Ⅱ基因启动子P3调控腺病毒介导HSV-tk/GCV系统，并从体内外观察其对肝癌细胞靶向性杀伤作用。 本实验主要分为以下四个部分： 第一部分：肝癌细胞中IGF-Ⅱ启动子P3活性研究 目的：检测肝癌细胞株HepG2、SMMC-7721、Bel-7402及宫颈癌细胞株HeLa细胞中IGF-Ⅱ胚胎性启动子P3活性，为下一步实验提供依据。 方法：采用半定量RT-PCR方法检测检查HepG2、SMMC-7721、Bel-7402及HeLa细胞中IGF-Ⅱ胚胎性启动子P3特异性mRNA表达。 结果：HeLa细胞未见有表达，肝癌细胞株中表达分别为HepG2(1.753±0.119)、SMMC-7721(1.250+0.096)和Bel-7402(0.333+0.055)，相对表达量HepG2＞SMMC-7721＞Bel-7402(P＜0.05)。 结论：HeLa细胞中IGF-Ⅱ胚胎性启动子P3无活性，肝癌细胞株中IGF-Ⅱ胚胎性启动子P3相对活性由高到低依次为HepG2、SMMC-7721和Bel-7402。 第二部分：IGF-Ⅱ启动子P3调控融合基因穿梭质粒构建及鉴定 目的：构建IGF-ⅡP3启动子驱动单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合基因穿梭质粒，为重组腺病毒载体作准备。 方法：应用基因工程技术首先将tk和EGFP置于同一阅读框并插入腺病毒穿梭质粒pDC316中，构建出巨细胞病毒(CMV)启动子调控融合基因穿梭质粒pDC316-tkEGFP-CMV，然后将该质粒中CMV启动子替换为IGF-ⅡP3启动子，构建出IGF-ⅡP3启动子调控tk和EGFP融合基因穿梭质粒pDC316-tkEGFP-P3，并进行酶切和测序鉴定。 结果：酶切鉴定和测序分析证实重组质粒中插入融合目的基因片断、IGF-ⅡP3启动子及载体DNA大小、方向和插入位点正确。 结论：成功构建了IGF-HP3启动子调控携带tk与EGFP融合基因穿梭质粒载体，为进一步重组腺病毒奠定物质基础。 第三部分：腺病毒载体重组、纯化、鉴定和滴度测定 目的：重组腺病毒载体，并进行扩增、纯化、鉴定和测定滴度，为体内外实验作准备。 方法：应用脂质体介导腺病毒穿梭质粒和腺病毒骨架质粒共转染293细胞方法进行腺病毒重组；PCR方法鉴定重组腺病毒；腺病毒纯化试剂盒纯化腺病毒；终点稀释法测定腺病毒滴度。 结果：穿梭质粒和骨架质粒共转染后第10～12天，293细胞开始出现病变(CPE)效应；PCR方法鉴定重组腺病毒正确；纯化后重组腺病毒纯度较好，Ad-tkEGFP-CMV和Ad-tkEGFP-P3滴度分别为6.0×109pfu/ml和6.5×109pfu/ml。 结论：成功重组并纯化了IGF-ⅡP3启动子调控携带tk与EGFP融合基因重组腺病毒(Ad-tkEGFP-P3)及CMV启动子调控携带tk与EGFP融合基因重组腺病毒(Ad-tkEGFP-CMV)。 第四部分：IGF-Ⅱ基因启动子P3调控腺病毒介导HSV-tk/GCV系统治疗肝癌的体内外研究 目的：观察IGF-Ⅱ基因启动子P3调控腺病毒介导HSV-tk/GCV系统对肝癌细胞及裸鼠肝癌移植瘤靶向性杀伤效应。 方法：Ad-tkEGFP-P3和Ad-tkEGFP-CMV转染HepG2、SMMC-7721、Bel-7402及HeLa细胞，荧光显微镜下计数荧光细胞测定转染效率；给予GCV，MTT法测定细胞对GCV敏感性；RT-PCR法测定转染细胞中tkmRNA表达；HepG2皮下接种法建立裸鼠肝癌移植瘤模型，瘤内注射重组腺病毒第二天腹腔注射GCV，4天一次测量肿瘤体积大小，描绘肿瘤生长曲线；实验结束后处死裸鼠剥离肿瘤测量体积大小；RT-PCR方法检测肿瘤及心、肝、肾脏组织中tk基因mRNA表达；HE染色常规病理学检查观察心、肝和肾脏毒性反应。 结果：相同MOIAd-tkEGFP-CMV转染率高于Ad-tkEGFP-P3对肝癌细胞株的转染率(P＜0.05)；转染了Ad-tkEGFP-P3的肝癌细胞HepG2、SMMC-7721、Bel-7402对GCV有不同程度的敏感性，而转染Ad-tkEGFP-P3的宫颈癌Hela细胞无敏感性，Ad-tkEGFP-CMV转染四种细胞对GCV均有敏感性；Ad-tkEGFP-CMV转染四种细胞中均检测出tk基因mRNA表达，而Ad-tkEGFP-P3转染四种细胞只在肝癌细胞株中检测出tkmRNA表达；成功构建裸鼠肝癌移植瘤模型，成瘤率100﹪，Ad-tkEGFP-P3+GCV治疗组裸鼠，其肿瘤生长显示被明显抑制，至第22日始，其体积明显小于其他各组(P＜0.05)；实验结束后剥离出的肿瘤，Ad-tkEGFP-P3+GCV组肿瘤明显小于其他组；只在肿瘤组织中可见有tkmRNA特异性表达，心、肝和肾脏未见表达；作常规HE染色病理检查，发现三种重要器官病理正常，未见有炎症、变性、坏死和细胞凋亡等现象 结论：Ad-tkEGFP-P3能特异性转染三种人肝癌细胞株，转染率低于人巨细胞病毒(CMV)启动子调控的重组腺病毒Ad-tkEGFP-CMV对相同细胞的转染率；IGF-Ⅱ胚胎型启动子P3能驱动外源基因特异性表达于肝癌细胞；IGF-Ⅱ基因启动子P3调控腺病毒介导HSV-tk/GCV系统能特异地杀伤肝癌细胞，对宫颈癌细胞无明显杀伤作用；IGF-Ⅱ基因启动子P3调控腺病毒介导HSV-tk/GCV系统可以抑制裸鼠肝癌移植瘤的生长，具有肝癌靶向基因治疗的可行性；IGF-Ⅱ基因启动子P3调控腺病毒介导HSV-tk/GCV系统对裸鼠无明显毒性反应。

目录

论文说明：资助

独创性声明及学位论文版权使用授权书

摘要

前言

第一部分 肝癌细胞中IGF-Ⅱ启动子P3活性的研究

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

第二部分 腺病毒穿梭质粒的构建及鉴定

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

第三部分 腺病毒载体重组、纯化、鉴定和滴度测定

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

第四部分 携带IGF-II启动子的腺病毒载体介导的HSV-tk/GCV系统治疗肝癌的体内外研究

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

全文结论

参考文献

致谢

缩写词中英对照

在校期间发表的论文

综述：转录靶向与肝癌基因治疗