环境镉暴露人群尿液中小分子代谢产物表征差异研究

摘要

环境镉污染对机体健康损害研究一直是近几十年来公共卫生领域研究的热点问题。资料显示,镉为已知的最易在体内蓄积的毒物之一,长期镉暴露与肾脏损伤、骨骼损害、心血管疾病等存在正相关关系,镉暴露是众多损害的危险因素,其导致患者死亡率增加,尤以女性更甚,肾损害是镉暴露引起的最早期关键效应。
　　在镉的健康损害效应研究中,国际上将尿镉作为公认的内暴露指标以反映体内镉负荷水平,尿β2-MG、NAG等效应性生物标志物作为早期肾损伤监测指标,被广泛应用,是镉中毒人群临床诊断和治疗的重要参考依据。
　　人们对于镉的生理代谢过程仍知之甚少,对镉的健康危害的机理仍有许多未明之处。本研究拟采用代谢组学法,探索环境镉长期暴露人群尿中显著变化的小分子代谢产物,从代谢途径角度寻找环境镉暴露对机体健康损害的证据,为进一步寻找环境镉暴露健康损害相关的生物标志物提供线索。
　　研究目的：
　　探索环境镉长期暴露人群尿中显著变化的小分子代谢产物,为寻找环境镉暴露健康损害相关的生物标志物提供线索。
　　研究方法：
　　1.流行病学调查
　　1.1调查对象
　　根据历史资料和研究目的,选择某环境高镉矿区作为环境镉暴露区,选择无明确重金属污染史,与暴露区经济水平相当、居民生活条件和生活习惯相似的地区作为对照区进行现场调查。选择本地居住时间15年以上,以居民家中自产大米和蔬菜为主要食物来源的45-70岁女性为调查对象,排除肝肾疾病及慢性代谢性等疾病。
　　1.2样本的采集、运输及保存
　　大米和蔬菜的采集、运输及保存
　　采集调查对象当季家中自种自食大米和叶类蔬菜各一份,统一编号并记录;统一将收集的大米和新鲜蔬菜迅速送至实验室,分析前储存于-4℃冷库。
　　尿样的收集、运输及保存
　　收集调查对象空腹晨尿贮存于冷藏箱中,迅速送至实验室,分装至冻存管用于相关分析;尿镉、肌酐、β2-MG和NAG检测工作在样品收集后8 h内完成;进行HPLC-Q/TOF检测的尿样储存于-80℃低温冰箱中。
　　1.3检测指标及方法
　　外暴露指标：
　　以大米和蔬菜镉含量作为外暴露指标,采用ICP-MS进行检测。
　　内暴露指标：
　　以尿镉作为内暴露指标,采用ICP-MS进行检测。
　　肾损伤生物标志物
　　以尿肌酐、NAG和β2-MG作为镉暴露相关的肾损伤生物标志物,采用苦味酸法测定尿中肌酐含量,采用免疫比浊法检测尿中β2-MG和NAG的含量。
　　2.尿液代谢组学分析
　　2.1代谢组学分析技术平台
　　样本前处理：
　　尿样室温下解冻后涡旋2min,移取100μL加入配置内标溶液,充分混合后离心10min,移取上清液后再次离心,将二次离心获得的上清液上机分析。
　　液相色谱条件：
　　采用C18反相色谱柱,柱温保持在50℃,一次进样量为5μL;流动相A:纯水+0.1％甲酸,B:甲醇+0.1%甲酸,流速0.4 mL/min,执行梯度洗脱程序。
　　质谱条件：
　　电离源:ESI,毛细管电压:3500 V,干燥气温度:350℃,流速:10.0 L/min-1,雾化压力:30 psi,质荷比(m/z)检测范围:50~1000。
　　2.2代谢组学数据处理平台
　　采用SPSS13.0进行秩和检验和ROC曲线绘制等;采用MPP12.1进行色谱峰的识别和前处理;运用SIMCA-P13.0进行PCA和OPLS-DA分析,筛选VIP值较大的小分子代谢产物;通过数据库,对筛选的代谢产物进行鉴定。
　　3.质量控制
　　现场调查人员经过统一培训,严格按照纳入排除标准选择调查对象;尿样、大米和蔬菜在运输过程中保持冷链;各项指标检测均由实验室相关专业人员承担,测定前调试仪器稳定性,样品进样顺序随机,样品间穿插空白样和质控样,要求质控样中内标物丰度及保留时间RSD小于10%。
　　结果：
　　1.流行病学资料
　　1.1人口学资料
　　根据研究目的和纳入排除标准,本研究以60名女性为调查对象,暴露组与对照组各30人,年龄分别为55.3±6.99岁和59.7±7.52岁。
　　1.2调查对象外暴露水平
　　分析暴露组和对照组人群食用自产大米各30份,蔬菜各30份,与对照组相比,暴露组米镉和菜镉含量增高,差异均具有统计学意义(P<0.001)。
　　1.3调查对象内暴露水平
　　对照组和暴露组人群尿镉含量中位数分别为1.95μg/g.Cr和8.33μg/g.Cr,分析发现,暴露组人群尿镉含量高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.001)。
　　1.4调查对象肾损伤相关生物标志物水平
　　对照组与暴露组人群尿肌酐中位数分别为84.38 mg/dL和85.25 mg/dL,其差异无统计学意义(P>0.05);对照组与暴露组人群尿NAG含量中位数分别为5.50 U/g.Cr和6.18 U/g.Cr,其差别无统计学意义(P>0.05);对照组与暴露组人群尿β2-MG含量中位数分别为0.04 mg/g.Cr和0.07 mg/g.Cr,其差别无统计学意义(P>0.05)。提示与对照组人群相比,本研究中环境镉暴露组人群未见肾损害。
　　2.代谢组学分析
　　2.1检测系统的稳定性和精密度
　　正离子模式(ESI+)下,QC样中内标物丰度值和保留时间的RSD分别为5.13%和0.06%,负离子模式(ESI-)下分别为2.00%和0.06%。提示该检测系统的稳定性和精密度符合代谢组学分析要求。
　　2.2模式识别
　　通过HPLC-Q/TOF检测出两组人群尿液中有效代谢物共2351个;经非参数检验,与对照组相比,暴露组人群尿液中有139个代谢物发生变化(P<0.05);将这139个代谢物用于模式识别分析,建立PCA和OPLS-DA模型,发现暴露组和对照组人群尿液呈现不同的代谢轮廓,建立的OPLS-DA模型能够解释两组人群尿液中全部变异的96.7%,模型对未知样本的判别准确率为95.3%,说明建立模型效果良好。结果表明暴露组人群尿液中存在的某些小分子代谢产物,表现出与对照组不同的特征。
　　2.3镉暴露引起变化的代谢产物分析
　　采用VIP值、z值等方法筛选了9个具有显著性差异的小分子代谢产物,它们在暴露组人群尿液中均呈现上调趋势,其AUC值为0.658-0.714,表明通过观察这些代谢产物的变化能够较好地将环境镉暴露组与对照组人群区分开来。它们可望作为环境镉暴露相关的特征性代谢物提供重要线索。这9个代谢产物主要为核苷类化合物、脂类化合物和氨基酸类化合物等。
　　结论：
　　1、通过HPLC-Q/TOF技术对环境镉暴露人群尿液代谢产物进行分析,鉴定出9个有显著变化的小分子代谢产物,它们在暴露组人群尿液中均呈现上调趋势。这9个代谢物主要与氨基酸代谢、脂类代谢、核苷酸代谢有关;
　　2、与经典的镉暴露肾损伤早期生物标志物相比,代谢组学分析能够更早的发现环境镉暴露对机体作用的微观变化和生理生化作用,本研究结果对深入探讨镉损害机制及进一步确认其作为生物标志物提供了重要线索。

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第1章 前 言

第2章 材料与方法

2.1 仪器和试剂

2.2 现场流行病学调查

2.3 尿液代谢组学分析

2.4 数据处理分析

2.5 质量控制及知情同意

第3章 结 果

3.1 流行病学资料

3.2 代谢组学分析

第4章 讨 论

4.1 流行病学调查

4.2 代谢组学分析

第5章 结 论

参考文献

附件

攻读学位期间参与科研工作情况

致谢