Wnt/β-catenin信号通路在氯化镉诱导HEK 293细胞增殖兴奋效应中的作用研究

摘要

研究目的:
　　研究Wnt/β-catenin信号通路在氯化镉诱导HEK293细胞增殖的毒物兴奋效应中的作用,探讨氯化镉所致细胞增殖兴奋效应的机制,为进一步理解毒物兴奋效应及其安全性提供参考。
　　研究方法与研究内容:
　　1.针对β-catenin基因序列设计并合成三对 shRNA,构建shRNA质粒载体,干扰HEK293细胞β-catenin基因mRNA表达,阻断细胞Wnt/β-catenin信号通路。
　　2.CCK-8法检测不同剂量氯化镉对 HEK293细胞增殖的影响,建立氯化镉所致 HEK293细胞增殖兴奋效应模型,并确定毒物兴奋效应剂量范围(Hormetic Zone)。
　　3.CCK-8法检测不同剂量氯化镉对β-catenin基因干扰 HEK293细胞增殖的影响,探讨Wnt/β-catenin信号通路在氯化镉所致细胞增殖兴奋效应中的作用。
　　4.实时荧光定量 PCR法检测不同剂量氯化镉作用于 HEK293细胞与β-catenin基因干扰HEK293细胞24h后Cyclin D1、c-myc基因的表达水平。
　　5.流式细胞术检测不同剂量氯化镉作用于HEK293细胞与β-catenin基因干扰的HEK293细胞24h后细胞周期的变化。
　　研究结果:
　　1.构建出含三个目的基因干扰序列的shRNA质粒载体,利用RT-PCR和Western Blot筛选出一个有效的shRNA质粒载体,其对β-catenin基因mRNA表达抑制率为67.68％、蛋白表达抑制率为61.27%。
　　2.氯化镉作用于HEK293细胞24h,0.1μmol/L~1μmol/L剂量组的细胞相对增殖率高于空白对照组,表现出细胞增殖的homersis效应。氯化镉作用于 HEK293细胞48h,0.001μmol/L~0.5μmol/L剂量组细胞相对增殖率高于空白对照,表现出细胞增殖的homersis效应。
　　3.氯化镉作用于β-catenin基因干扰HEK293细胞24h,只有0.5μmol/L剂量组细胞相对增殖率高于空白对照,表现出细胞增殖的homersis效应;低剂量氯化镉作用于β-catenin基因干扰的HEK293细胞48h后,没有出现细胞增殖的homersis效应。
　　4.荧光定量PCR结果发现,氯化镉作用于HEK293细胞24h,0.01μmol/L~1μmol/L剂量组细胞 Cyclin D1基因相对表达量升高,与对照组比较具有统计学意义(P<0.05),Cyclin D1表达量呈现先升高后降低趋势,在1μmol/L氯化镉作用下Cyclin D1表达水平达到最高值。氯化镉作用于β-catenin基因干扰HEK293细胞24h,各剂量组Cyclin D1表达水平与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。
　　5.荧光定量PCR结果发现,氯化镉作用于HEK293细胞24h,0.1μmol/L~10μmol/L剂量组细胞 c-myc基因相对表达量升高,与对照组比较具有统计学意义(P<0.05),氯化镉剂量与 c-myc表达量呈现线性剂量-反应关系,在10μmol/L氯化镉作用下 c-myc表达水平达到最高值。氯化镉作用于β-catenin基因干扰HEK293细胞24h,10μmol/L剂量组 c-myc表达水平升高,与对照组比较差异统计学意义（P<0.05),0.01μmol/L~1μmol/L剂量组 c-myc表达水平与对照组比较差异无统计学意义（P>0.05)。
　　6.细胞周期分析结果发现,氯化镉作用于HEK293细胞24h后,0.1μmol/L、1μmol/L剂量组 G1期细胞百分比低于空白对照组(P<0.05),1μmol/L剂量组 S期细胞百分比高于空白对照组(P<0.05),而0.01μmol/L、0.1μmol/L、1μmol/L剂量氯化镉作用于β-catenin基因干扰HEK293细胞24h后,各剂量组细胞G1和S期百分比与空白对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。
　　结论:
　　1.低剂量氯化镉能诱导 HEK293细胞产生细胞增殖的毒物兴奋效应,Hormetic Zone为0.1μmol/L~1μmol/L(24h)、0.001μmol/L~0.5μmol/L(48h)。
　　2.Wnt/β-catenin信号通路在低剂量氯化镉诱导细胞增殖 hormesis效应中发挥重要作用,氯化镉可能通过激活Wnt/β-catenin信号通路上调Cyclin D1的表达进而改变细胞周期从而促进细胞增殖。

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目录

1 前 言

1.1 低剂量毒物兴奋效应

1.2 Wnt/β-catenin信号通路与hormesis的关系

1.3 RNA干扰技术

1.4 实验研究内容

2 实验材料及方法

2.1 实验材料

2.2 主要试剂配制

2.3 实验方法和步骤

2.4 统计分析

3 实验结果及分析

3.1 β-catenin重组质粒的构建和转染

3.2 氯化镉诱导HEK293细胞增殖的hormesis

3.3 荧光定量PCR检测Cyclin D1与c-myc基因的表达

3.4 流式细胞术检测细胞周期

4 讨论

4.1 shRNA质粒载体干扰β-catenin基因表达

4.2 氯化镉诱导HEK293细胞增殖的兴奋效应

4.3 Wnt/β-catenin对氯化镉诱导HEK293细胞增殖的兴奋效应的作用

4.4 低剂量氯化镉对Cyclin D1与c-myc基因表达的影响

4.5 低剂量氯化镉对HEK293细胞周期的影响

4.6 小结

5 结论

中英文缩略词表

参考文献

在读期间发表的论文

致谢