α2A肾上腺素能受体在脓毒症诱导的大鼠心脏血管内皮细胞活化中的作用

摘要

目的：先前的研究表明，a2A肾上腺素能受体（a2A-AR）阻断剂BRL44408可提高脓毒症大鼠的生存率、改善脓毒症大鼠的心功能并降低心脏肿瘤坏死因子-a（TNF-a）、细胞间黏附分子-1（ICAM-1）与血管细胞黏附分子-1（VCAM-1）的表达，但其作用靶点尚不明确。业已证明，血管内皮细胞上存在a2A-AR。显然，BRL44408降低心脏 TNF-a与黏附分子的表达可能与其作用于心脏血管内皮细胞从而抑制脓毒症诱导的心脏内皮细胞活化相关。因此，本研究分别观察了a2-AR激动剂和/或a2A-AR阻断剂对脓毒症大鼠心脏、内毒素（LPS）灌流的离体心脏及培养的心脏微血管内皮细胞产生 TNF-a、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和黏附分子的影响，进一步探讨a2A-AR在脓毒症心脏血管内皮细胞活化中的作用与相关机制。
　　方法:
　　1.通过盲肠结扎穿孔术（CLP）复制脓毒症大鼠模型，用Western blot观察CLP对大鼠心脏组织中a2A-AR的表达量有无影响，并进一步通过免疫荧光染色技术对a2A-AR进行定位。
　　2.用Western blot分析和免疫荧光染色方法观察a2A-AR阻断剂BRL44408对脓毒症大鼠心脏组织及心脏血管内皮TNF-a、ICAM-1、VCAM-1和iNOS表达的影响。
　　3.通过免疫荧光染色技术观察a2-AR的激动剂盐酸右美托咪啶（DEX）对脓毒症大鼠心脏血管内皮TNF-a、ICAM-1、VCAM-1和iNOS表达的影响，并观察两种不同剂量的DEX对脓毒症大鼠生存率的影响。
　　4.采用Langendorff离体心脏灌流技术，观察LPS和/或a2-AR激动剂B-HT933对离体大鼠心功能的影响；用ELISA法检测灌流液中TNF-a的浓度；荧光定量PCR法检测心脏组织中TNF-a、ICAM-1和VCAM-1 mRNA的表达；免疫荧光染色技术观察离体心脏灌流2h后心脏内皮细胞上上述炎症介质的表达。
　　5.培养心脏微血管内皮细胞，通过免疫荧光染色技术进行鉴定、并观察a2A-AR在心脏微血管内皮细胞上的表达；用1μg/mL的LPS刺激内皮细胞，通过荧光定量PCR法观察a2-AR激动剂B-HT933和/或?2A-AR阻断剂BRL44408对LPS刺激后2 h内皮细胞中TNF-a、ICAM-1和VCAM-1 mRNA表达的影响；通过Western blot分析观察a2-AR激动剂和/或a2A-AR阻断剂对LPS刺激0.5 h后心脏微血管内皮细胞中IkBa、p38 MAPK、JNK和ERK磷酸化的影响。
　　结果:
　　1. CLP诱导6 h对大鼠心脏组织a2A-AR的表达量无明显影响；心脏组织冰冻切片免疫荧光染色显示，心脏血管内皮细胞上存在a2A-AR。而肺组织冰冻切片免疫荧光染色显示，肺血管内皮上未见?2A-AR的表达。
　　2. a2A-AR阻断剂BRL44408可降低CLP术后6 h大鼠心脏组织中TNF-a、ICAM-1、VCAM-1和iNOS的表达；免疫荧光染色结果显示，与CLP组相比，a2A-AR阻断剂BRL44408处理的脓毒症大鼠心脏血管内皮细胞上上述炎症细胞因子的表达也相应减少，而BRL44408处理并不影响脓毒症大鼠肺血管内皮上ICAM-1和VCAM-1的表达。
　　3.a2-AR的激动剂DEX处理的CLP组，CLP术后6 h心脏血管上TNF-a、ICAM-1、VCAM-1和iNOS的表达明显强于CLP组；40μg/kg的DEX对脓毒症大鼠死亡率无显著影响，但腹腔注射80μg/kg的DEX可显著增加脓毒症大鼠的死亡率。
　　4. a2-AR的激动剂B-HT933可加重LPS灌流诱导的大鼠离体心脏心功能障碍；在灌流早期，B-HT933与LPS共同灌流组，灌流液中TNF-a的浓度显著高于LPS单独灌流组；LPS灌流后大鼠心脏组织中TNF-a、ICAM-1和VCAM-1 mRNA的表达显著高于对照组，而B-HT933显著增加了LPS诱导的TNF-a、ICAM-1和VCAM-1 mRNA的表达；LPS灌流2 h后，心脏免疫荧光染色结果显示，LPS可增加心脏血管内皮细胞TNF-a、ICAM-1和VCAM-1的表达，而B-HT933可加强LPS的这一反应。
　　5.通过免疫荧光技术对培养的原代细胞进行鉴定，证实其为心脏微血管内皮细胞，并且观察到内皮细胞上有a2A-AR的表达；LPS刺激心脏微血管内皮细胞后，细胞中TNF-a、ICAM-1和VCAM-1 mRNA表达量显著升高，B-HT933处理心脏微血管内皮细胞显著加强LPS诱导的TNF-a和ICAM-1mRNA的表达，而a2A-AR的阻断剂BRL44408预处理可消除B-HT933的增强效应；LPS处理增强了心脏微血管内皮细胞IkBa和p38 MAPK的磷酸化，B-HT933预处理通过a2A-AR依赖的方式促进LPS诱导的IkBa和p38 MAPK的磷酸化。
　　结论:
　　1.大鼠心脏血管内皮细胞上存在a2A-AR。
　　2.阻断a2A-AR可降低脓毒症大鼠心脏血管内皮细胞TNF-a、ICAM-1、VCAM-1和iNOS的表达，抑制脓毒症诱导的心脏血管内皮细胞活化。
　　3.激活心脏血管内皮细胞上的a2-AR可加重CLP和LPS诱导的心脏血管内皮细胞活化、并加重LPS诱导的心脏功能障碍。a2A-AR的活化可能通过增强NF-kB和p38 MAPK的磷酸化增加LPS诱导的心脏内皮细胞炎症细胞因子和黏附分子的表达。

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前言

1. 脓毒症性心功能障碍

2. 内皮细胞与脓毒症性心功能障碍

3.a2A肾上腺素能受体与脓毒症心功能障碍和脓毒症诱导的心脏血管内皮细胞活化

4. 本研究的科学假说与研究目的

第一部分 心脏血管内皮细胞上存在a2A-AR

1.1 材料和方法

1.2 结 果

第二部分 BRL44408治疗降低脓毒症大鼠心脏及心脏血管内皮细胞上ICAM-1、VCAM-1、TNF-a和iNOS的表达

2.1材料和方法

2.2 结 果

第三部分 盐酸右美托咪啶增强脓毒症大鼠心脏血管内皮细胞ICAM-1、VCAM-1、TNF-a和iNOS的表达，增加死亡率

3.1 材料和方法

3.2 结 果

第四部分 a2-AR激动剂B-HT 933加重LPS诱导的离体心功能障碍及心脏内皮细胞ICAM-1、VCAM-1和TNF-a 的表达

4.1 材料和方法

4.2 结 果

第五部分 a2A-AR激活通过促进p 38 MAPK及IkBa磷酸化加强

5.1 材料和方法

5.2 结 果

讨论

结论

参考文献

·英文缩略词表

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