基于冷通道蛋白TRPM8及TRPA1探讨当归对低温诱导的异常疼痛及血管反应的调控机制

摘要

本课题基于冷通道蛋白 TRPM8及 TRPA1，探讨了当归对低温诱导的异常疼痛及血管反应的调控机制。当归四逆汤是治疗血虚寒凝证的主方，以疼痛及周围循环障碍为主要特征。当归是该方的君药，故本实验分为在体研究及离体细胞两部分，前者研究对象为当归，后者研究对象为当归的主要成分阿魏酸及 Z-藁本内酯。
　　1.当归对大鼠奥沙利铂周围神经毒性模型及其局部低温异常血管反应的修复作用
　　目的：以TRPM8及TRPA1蛋白为切入点，探讨急性及慢性奥沙利铂周围神经毒性模型中疼痛与低温诱导的局部表皮异常血管反应中的相关性。由于当归具有拟雌激素样作用，奥沙利铂周围神经毒性在不同性别人群中具有不同的临床特征，因此，在此基础上探讨当归及雌二醇的治疗作用及机制。
　　方法：将雌性SD大鼠随机分为空白对照组（急性及慢性各1组）、奥沙利铂急性周围神经毒性模型组（第1、2天腹腔注射奥沙利铂6mg/kg）、奥沙利铂慢性周围神经毒性模型组（第1、2、7、8、14、15天腹腔注射奥沙利铂溶液6mg/kg）、雌二醇治疗组（模型组基础上，急性组于第1、2、3天，慢性组于第1、2、4、7、8、10、14、15、17天予以背部皮下注射17β-雌二醇200ug/100g）、当归治疗组（模型组基础上，急性组于1、2、3天，1、2、4、7、8、10、14、15、17天灌胃当归颗粒剂溶液0.2mg/100g）、氟维司群（雌激素受体拮抗剂）+当归治疗组（慢性当归治疗组基础上，第1、2、4、7、8、10、14、15、17天灌胃当归前予以皮下注射氟维司群溶液0.5mg/100g）。在不同时间点进行疼痛行为学测试；取材当天戊巴比妥钠麻醉大鼠后，同侧足部预先予以皮下注射 TRPA1拮抗剂HC030031或TRPM8拮抗剂 AMTB，对侧足部予以生理盐水皮下注射作为对照组，采用激光多普勒血流仪测量大鼠足底某固定位置的基线血流，及2分钟冷水刺激后20分钟以内的血流变化；血流测量结束后，取足部皮肤进行CGRP、NO代谢物及去甲肾上腺素含量测定；取大鼠背根神经节，Western blot检测TRPM8及TRPA1蛋白含量，免疫荧光测量CGRP含量；取大鼠坐骨神经，予以HE染色及LFB髓鞘染色判断坐骨神经损伤情况。
　　结果：奥沙利铂急性及慢性周围神经毒性模型均表现出明显的冷敏感、冷痛觉及机械性痛觉，当归对急性模型的冷痛觉及冷过敏有缓解作用，雌二醇对急性模型的机械痛觉有缓解作用，两者均可显著抑制慢性模型的冷痛觉、冷过敏及机械痛觉，阻断雌激素受体可明显抑制当归的缓解作用。急性模型背根神经节中的TRPM8及TRPA1蛋白含量明显增加，当归可显著抑制TRPA1含量增加；慢性模型TRPA1蛋白含量明显增加，雌二醇及当归均可显著减少TRPA1的增加，阻断雌激素受体可明显抑制当归的作用。急性模型背根神经节CGRP阳性细胞比例增加，雌二醇及当归均可显著抑制CGRP阳性细胞比例；慢性模型中，CGRP阳性细胞比例增加，雌二醇及当归对此有部分抑制作用，阻断雌激素受体不能减少当归的抑制作用。急性模型，坐骨神经没有明显的形态学改变，雌二醇及当归对其也没有明显影响；慢性模型，坐骨神经出现有髓鞘神经纤维数量减少，及明显的炎症细胞浸润，雌二醇及当归对坐骨神经损伤具有一定修复作用，阻断雌激素受体可明显抑制当归的修复作用。正常对照组低温刺激后出现单向收缩血流变化，且HC030031或AMTB可明显抑制收缩。急性及慢性模型组，低温刺激后出现双向先舒张后收缩血流变化，HC030031可明显抑制舒张及其后的收缩；雌二醇治疗组可减少舒张程度；当归治疗组恢复为正常的单向收缩。正常对照组，低温刺激后足部的CGRP及NO代谢物水平没有显著变化；急性及慢性模型组基线CGRP水平及 NO代谢物水平没有变化，急性及慢性模型组冷刺激后 CGRP明显增加，予以HC030031可明显抑制CGRP的增加，雌二醇对急性模型组的CGRP含量起到部分减少的作用，而对慢性模型组没有影响，当归可明显抑制CGRP增加，雌激素受体拮抗剂不影响当归的抑制作用；急性模型组基线冷刺激后NO代谢物水平没有变化，慢性模型组冷刺激后NO代谢物水平明显增加，HC030031或AMTB均不抑制其增加，雌二醇对此没有作用，当归可明显抑制NO代谢物的增加，雌激素受体拮抗剂不影响当归的抑制作用。
　　结论：本实验首次发现了奥沙利铂周围神经毒性模型的低温诱导后的异常血管舒张、雌二醇及当归通过雌激素受体对该疼痛模型的治疗作用，以及当归对该模型异常血管反应的逆转作用。急性及慢性奥沙利铂模型均出现明显的疼痛反应及低温刺激后异常血管舒张，疼痛可能与TRPM8、TRPA1、疼痛标志物CGRP及坐骨神经损伤有关，异常血管舒张可能与局部的TRPM8/TRPA1通路、感觉神经纤维CGRP的释放及局部NOS/NO系统的异常调节有关。雌二醇及当归可通过上述部分机制缓解疼痛，并恢复局部皮肤血管对低温刺激的正常反应。
　　2. Z-藁本内酯及阿魏酸对胸主动脉平滑肌细胞TRPM8/TRPA1功能及表达的协同调节作用
　　目的：探讨TRPM8及TRPA1对胸主动脉平滑肌细胞收缩的“钙依赖性途径”及“钙敏感性途径”信号通路的作用，及低温对TRPM8及TRPA1表达的影响。在此基础上探讨Z-藁本内酯及阿魏酸对其的作用，并根据Chou and Talay方法，计算两药联用是否具有相加、协同或拮抗作用。
　　方法：采用Fluo-4钙离子指示剂孵育HASMC，分别予以RyR抑制或IP3R抑制剂预孵育排除 CICR干扰后，予以 TRPM8激动剂 WS-12或 TRPA1激动剂 ASP7663刺激HASMC，记录荧光变化率。检测不同浓度的Z-藁本内酯或阿魏酸对WS-12或ASP7663引起的最大荧光强度的抑制作用，根据ED50确定联合用药的药物浓度，使用软件Calcusyn计算不同药效下的合并指数。根据上述药物浓度，采用GST pull-down及Western blot检测Z-藁本内酯、阿魏酸及混合药物对WS-12或ASP7663引起的RhoA活性、p-MLC/t-MLC变化的影响。将HASMC放入10℃的全温培养箱孵育4小时，采用qRT-PCR法检测TRPM8及TRPA1 mRNA水平变化，检测不同浓度的Z-藁本内酯或阿魏酸对其的抑制作用，根据 ED50确定联合用药的药物浓度，使用软件Calcusyn计算不同药效下的合并指数。
　　结果：WS-12及ASP7663均可引起HASMC细胞内钙离子浓度的升高，前者与外钙内流及RyR受体内钙释放有关，后者与外钙内流及RyR受体/IP3受体的内钙释放有关。在排除CICR的影响后，阿魏酸及Z-藁本内酯对WS-12或ASP7663引起的荧光变化成浓度依赖性的抑制作用，ED50值分别为（9.124±1.04μM）及（6.836±1.13μM），根据ED50值确定混合药物浓度梯度，合并指数CI＜1。ASP7663可引起HASMC RhoA活性及p-MLC/t-MLC增加，WS-12可引起p-MLC/t-MLC增加，阿魏酸、Z-藁本内酯及混合药物组均可显著抑制ASP7663或WS-12引起的变化，与阿魏酸组或 Z-藁本内酯组相比，混合药物组对 MLC磷酸化水平有更明显的抑制作用。低温（10℃，4小时）可显著增加HASMC TRPM8 mRNA水平，阿魏酸及Z-藁本内酯均能显著减少TRPM8 mRNA的增加，ED50分别为（3.416±1.05μM）及（2.325±1.06μM），根据ED50值确定混合药物浓度梯度，合并指数CI＜1。
　　结论：TRPM8或TRPA1的激活均可引起胸主动脉平滑肌细胞的收缩，前者主要通过钙依赖途径引起细胞收缩，后者则可以同时激活钙依赖性途径及钙敏感性途径中的关键靶点RhoA激酶。低温可显著增加TRPM8 mRNA表达。阿魏酸及Z-藁本内酯对上述作用靶点具有协同抑制作用。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

中英文缩略词表

目录

1 前言

1.1 TRPM8与TRPA1情况概述

1.2 TRPM8、TRPA1与冷痛

1.3 TRPM8、TRPA1与血管张力

1.4 当归对疼痛、平滑肌及血管反应的调控作用

1.5 项目的立题依据及设计思路

2 实验一 当归对奥沙利铂周围神经毒性模型及其局部低温异常

2.1材料

2.2实验方法

2.3 实验结果

3 实验二、Z-藁本内酯及阿魏酸对胸主动脉平滑肌细胞TRPM8/TRPA1功能及表达的协同调节作用

3.1材料

3.2实验方法

3.3 实验结果

4 讨论

4.1 通过奥沙利铂周围神经毒性模型，探讨了疼痛与异常血管舒缩的关系

4.2 雌二醇与当归在治疗奥沙利铂周围神经毒性模型中的不同作用

4.3 探讨当归对低温引起血管收缩抑制作用的分子基础

5 结论及结语

5.1 结论

5.2 研究的创新之处

5.3 研究的不足之处

参考文献

在学期间发表论文清单

致谢