人体胃肠道微生态消化模拟系统的构建及其稳定性评估

摘要

近年来，人们对食品安全以及营养物质的消化吸收等问题日益关注，人体体外消化模型在食品营养吸收、药物代谢、污染物生物可及性分析以及食品摄入安全评价等方面的应用越来越受到重视，但现有的人体体外消化模型大部分局限于胃和小肠、以及小鼠、大鼠等动物模型，不能从本质上模拟人体胃肠道微生态，也存在饲养成本高、繁殖率低、生命周期长以及伦理道德等问题。因此建立和发展一套灵活的、精确的、可重复操作的并且适应东方人饮食习惯的人体胃肠道微生态消化模拟系统用于营养学、毒理学、微生物学等领域成为新的研究方向。本论文涉及一种人体胃肠道微生态消化体外模拟系统（SmartGut。SG）的构建，并对该系统稳定性进行了可行性评估，具体工作如下：
　　1. SG系统的开发与设计。SG系统模型的建立是基于比利时根特大学人体肠道微生态系统模拟装置（SHIME）设计原理，结合东方人生活习性进行改进来达到在体外条件重现人体胃肠道系统。SG系统模型主要包括5罐3阶段—模拟人类的胃、小肠和大肠，包括：系统控制器、模拟消化系统、搅拌系统、时间控制系统、速率控制系统、气路控制系统、温度控制系统、pH反馈调节系统、料液试剂瓶、消化液试剂瓶、酸碱液试剂瓶，废液收集器。
　　2. SG系统模拟实验方法的建立。模拟实验方法主要包括：系统各阶段运行时间、物料蠕动速度及其他参数设定，粪便接种液制备，肠道微生态的增值和稳定，胃和小肠消化液、营养液制备，消化模拟以及各项稳定参数的测定等步骤。
　　3. SG系统稳定性的可行性评估。主要包括4部分系统参数的测试与评估，具体结果如下：
　　（1）采用2名年龄在20~35岁且半年内未服用抗生素药物的健康寄主的粪便分别进行剪切和涡旋两种不同方法的制备粪便接种液并置于-80℃冰箱储存。利用细菌培养技术和变性凝胶电泳（PCR-DGGE）技术对接种液储存周期内的微生态结构的变化进行评估，结果显示第3、6、12、18、24天时接种液中乳酸杆菌、总厌氧菌和总好氧菌的数量以及DGGE指纹图谱结构与第0天对照无明显变化，推测本实验制备的粪便接种液在-80℃储存过程中处于稳定状态，Ⅰ号受试者粪便中微生物的富集程度高，更适合于SG系统的粪便接种液制备，且利用剪切法制备的粪便接种液更适合于SG系统。
　　（2）对SG系统运行周期内升结肠罐、横结肠罐、降结肠罐发酵液样品中乳酸菌、大肠杆菌、总好氧菌的数量进行测定。SG系统运行周期的前5天，乳酸菌、大肠杆菌、总好氧菌的数量在升结肠、横结肠、降结肠内波动变化，其中乳酸菌的数量在波动期内呈上升趋势，而大肠杆菌以及总好氧菌的数量呈明显下降趋势，从第7天开始进入稳定期，各个菌种的数量在大肠的各个阶段中维持稳定状态，推测SG系统在加入粪便接种液的前5天为波动期，从第7天开始进入稳定期。
　　（3）采用PCR-DGGE技术，对SG系统运行周期内每天6:00和12:00两个时段升结肠、横结肠以及降结肠发酵液中的细菌多态性进行分析，得到以下结论：SG系统在其运行周期内，第1天系统内细菌菌落的种类和数量最少，微生物处于对新的生长环境的适应期，从第2天开始细菌的种类和数量明显增多，微生物的生长处于对数增长期，并从7天左右进入稳定期，且进入稳定期后SG系统中细菌菌落的种类和数量基本相同，微生态结构最为稳定；SG系统在6:00和12:00两个时段的细菌多态性差别并不明显，证明系统在达到稳定后，进食时间对系统微生态结构的变化几乎无影响；在系统的3个不同大肠阶段，降结肠中细菌菌落的种类和数量最多，横结肠次之，升结肠中相比最少。
　　（4）采用气相色谱-氢火焰离子化检测（GC-FID）技术，对SG系统升结肠、横结肠以及降结肠发酵液中的短链脂肪酸含量进行分析，得以下结论：
　　SG系统中微生态在系统运行过程中代谢产生短链脂肪酸，主要有乙酸、丙酸、丁酸以及戊酸。代谢产生的乙酸最高值为86.40μg/mL，其次是丙酸和丁酸，戊酸的含量是最低为10.21μg/mL，
　　SG系统在系统运行周期内，前期总SCFA和各短链脂肪酸的含量保持总体上升趋势且有较大的波动，从第7天开始总SCFA和各短链脂肪酸的含量基本处于稳定状态，在一定范围内稍许波动。推测是由于系统运行前期系统各消化阶段的微生态结构不稳定，短链脂肪酸的含量随着微生物种类和数量的增多而增加，但当系统进入稳定期后，各消化阶段的微生态结构也趋于稳定，降结肠中菌群的数量和种类最多，微生态结构也最为复杂，因此对于生长环境中各种营养物质的需求量也必然大，当生长环境中的营养成分不足已维持降结肠中微生物正常的生理代谢时，就会开始消耗微生物自身代谢产生的短链脂肪酸，因此在系统进入稳定期后降结肠中的总SCFA的含量反而小于升结肠和横结肠的含量。
　　升结肠、横结肠、降结肠分别在不同一时刻（6:00和12:00）总SCFA和各短链脂肪酸的含量呈现一定的规律：12:00升结肠、横结肠和降结肠中总SCFA和各短链脂肪酸的含量明显高于6:00，推测是由于系统的肠道微生态经过一夜的无进食发酵已开始消耗微生物自身代谢产生的短链脂肪酸，因此早上6:00时系统中总SCFA和各短链脂肪酸的含量要比12:00时低。
　　本研究涉及到的人体胃肠道微生态消化模拟系统（SG）的构建及其稳定性评估，将对符合东方人饮食习惯的人体胃肠道微生态消化模拟系统的建立以及改进提供初步理论基础且具有借鉴意义。