核LDH-A在食管鳞癌中的表达情况及意义

摘要

目的：
　　食管癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，主要包括两种亚型：鳞癌和腺癌，其中鳞癌约占90％。我国是食管癌的高发区，尤以鳞癌为主，具有发病率高、死亡率高的特点。由于食管癌早期症状不明显，患者就诊时多属于中晚期，其5年总生存率仅约17%。寻找与预后相关的分子标记物对于食管癌的个体化治疗意义重大，能够为临床诊断、个体化治疗提供依据。
　　LDH是糖酵解途径的关键酶，包括A、B两种亚基，LDH-A除了位于细胞浆，也在细胞核中表达。本文对食管鳞癌组织标本中LDH-A核表达和浆表达水平单独进行评价，分别分析其与食管鳞癌患者临床病理特征的关系及对预后的影响，分析核LDH-A是否能够作为食管鳞癌新的预后指标，并在细胞水平对其功能进行探索，研究核LDH-A在食管鳞癌发生发展中可能发挥的功能，以期望未来通过评价LDH-A的亚细胞定位对食管鳞癌患者的风险评估和临床治疗提供参考。
　　方法：
　　1、收集临床上确诊为食管鳞癌患者的组织标本及相应的临床病理资料及随访资料，输入电脑，建立数据库。
　　2、检测并评价 LDH-A在癌组织及癌旁组织中的表达情况：免疫组织化学染色法检测 LDH-A在癌组织及癌旁组织中的表达情况，根据表达强度和表达范围分别对 LDH-A在癌组织及癌旁组织细胞不同部位的表达情况进行评价。根据免疫组化评分标准，核、浆表达水平均可以分为阴性、弱表达、中度表达和强表达4个等级，将阴性和弱表达归为低表达组，中度表达和强表达归为高表达组，再对两组数据进行统计分析。
　　3、χ2检验分别分析LDH-A核、浆表达在癌组织和癌旁组织间的差异。
　　4、分别分析 LDH-A核表达、浆表达水平与食管鳞癌患者临床病理特征之间的关系以及对预后的影响；运用Cox比例风险回归模型分析各暴露因素对患者死亡风险的影响。
　　5、检测LDH-A对食管癌细胞增殖的影响：细胞免疫荧光染色检测LDH-A在两株食管癌细胞株中的表达情况；克隆形成实验检测 LDH抑制剂 Galloflavin对食管癌细胞株增殖能力的影响；Western blot检测LDH抑制剂Galloflavin对食管癌细胞株中与肿瘤发展相关基因蛋白水平的表达。
　　结果：
　　1、免疫组织化学染色的结果显示，在癌组织的细胞核、浆部位均能检测到LDH-A的表达。LDH-A在癌组织中的表达水平远远高于癌旁组织，在84例患者的癌组织标本中，有47例患者为LDH-A核低表达，占56%；37例患者为LDH-A核高表达，占44%。而有52例患者为LDH-A浆高表达，所占比例高达61.9%。
　　2、LDH-A核表达水平与患者性别、肿瘤分期、淋巴结转移相关（P=0.005,0.026,0.022）。LDH-A浆表达水平与患者性别、年龄相关（P=0.025,0.012）。其中男性患者核、浆高表达所占的比例均高于女性；晚期患者和有淋巴结转移的患者中，LDH-A核高表达所占的比例明显高于早期患者和无淋巴结转移的患者。
　　3、84例患者的术后生存期从1个月到83个月不等，平均生存期和中位生存期分别是27.08个月和16个月，3年总生存率为16.9%。单因素生存分析结果显示，肿瘤分期、LDH-A核、浆表达水平均会影响患者的预后（P=0.039,0.004,0.038）。晚期患者、LDH-A核高表达患者或者LDH-A浆高表达患者，他们的平均生存期和中位生存期都是明显缩短的；当然，LDH-A核、浆均高表达的患者的预后是最差的（P＜0.001）。
　　4、多因素生存分析显示，与肿瘤分期、LDH-A浆表达水平相比，LDH-A核高表达是一个独立的危险因子，风险比为2.108。
　　5、免疫荧光共聚焦显微镜观察，LDH-A在食管癌细胞株Eca109和Eca9706中，不仅在细胞浆中表达，在细胞核中也被检测到，与组织中的表达定位一致；平板克隆形成实验结果显示，加入抑制剂后，细胞的平板克隆形成能力明显降低，不仅克隆形成个数减少，每个克隆中的细胞数也明显减少；Western blot结果显示，抑制剂Galloflavin处理细胞48h后，p-stat3和cyclinD1的蛋白表达水平明显下降。
　　结论：
　　1、LDH-A在食管鳞癌患者组织中的表达不仅存在于细胞浆中，且细胞核中也有表达；LDH-A在癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织。
　　2、LDH-A核表达水平与患者的性别、肿瘤分期及淋巴结转移相关。
　　3、LDH-A核、浆表达水平均对患者的预后有影响，核LDH-A对患者预后的影响更大，是一个独立的危险因素，可以作为一个新的预后指标。
　　4、LDH抑制剂 Galloflavin在体外影响细胞的增殖，可能与下调 p-stat3和cyclinD1的表达有关。

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前言

食管癌流行病学特征和研究现状

肿瘤细胞的代谢特点

乳酸脱氢酶的结构和功能

LDH-A在肿瘤的研究进展

研究内容及意义

技术路线

第一部分 LDH-A在食管鳞癌组织中的表达情况及预后价值

1. 材料

2．方法

3．结果

4．讨论

第二部分 抑制LDH-A对食管癌细胞增殖的影响

1. 材料

2．方法

3. 结果

4. 讨论

结论

参考文献

英文缩略词

研究生期间发表论文情况

本课题基金资助来源

致谢