白念珠菌ADH1缺失株对氟康唑的MIC及其外排泵相关机制的初步研究

摘要

目的:
　　探讨白念珠菌（Candida albicans）ADH1（alcohol dehydrogenase I）基因缺失后对氟康唑（fluconazole。FLC）的最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）的影响，并进而探讨其变化是否与外排泵机制相关。
　　方法:
　　以白念珠菌SC5314株、以其为亲本构建的白念珠菌ADH1基因缺失株EX2与回复株RE1为研究对象，按照美国临床与实验室标准协会（Clinical and laboratory standards institute，CLSI）M27-A3方案的微量稀释法测定FLC作用对这三株白念珠菌酵母相的MIC水平，以考察ADH1基因缺失后菌细胞对FLC的体外敏感性变化；并同时通过琼脂点板实验（spot assay）测定菌细胞对FLC的药物敏感性变化，以比较其在固体培养基上的结果与上述MIC值是否一致。通过罗丹明123的蓄积/外排实验测定FLC存在时三株菌株外排泵功能差异；并通过RT-PCR技术测定FLC作用对菌株外排泵相关基因（CDR1、CDR2、MDR1）在mRNA水平的表达情况差异，以考察ADH1基因缺失对白念珠菌外排泵功能及主要外排泵耐药基因表达的影响。通过检测线粒体膜电位、细胞内ATP水平初步考察ADH1基因敲除后对FLC敏感性的影响是否与能量代谢相关。
　　结果：
　　1.微量稀释法结果显示，白念珠菌ADH1缺失株EX2对FLC的MIC较亲本株SC5314及回复株RE1均降低，其中72小时后MIC50、MIC80均下降两个梯度，48小时后MIC50、MIC80均下降一个梯度；亲本株SC5314与回复株RE1之间对FLC的MIC50、MIC80在48小时、72小时均无差异。琼脂点板实验结果亦显示，ADH1缺失株EX2对FLC的敏感性较亲本株SC5314、回复株RE1升高，亲本株SC5314与回复株RE1之间对FLC的敏感性无明显差异。
　　2.蓄积实验后，缺失株EX2细胞内罗丹明123阳性细胞百分比分别为亲本株SC5314及回复株RE1的2.09倍及1.67倍(P<0.05)，EX2对罗丹明123的蓄积增加；外排实验后，缺失株EX2细胞内的罗丹明123阳性细胞百分比分别为亲本株SC5314及回复株RE1的2.27倍及2.13倍（P<0.05），EX2对罗丹明123的外排减少。亲本株SC5314及回复株RE1之间对罗丹明123的蓄积与外排均无明显差异（P>0.05）。
　　3. RT-PCR结果表明，ADH1缺失株EX2 MDR1基因在mRNA水平的表达分别为亲本株SC5314及回复株RE1的0.32倍、0.29倍(P<0.05)，CDR2基因在mRNA水平的表达分别为亲本株SC5314及回复株RE1的3.10倍、2.12倍(P<0.05),CDR1基因在mRNA水平的表达分别为亲本株SC5314及回复株RE1的1.42倍及1.18倍（P>0.05）。缺失株EX2中外排泵基因CDR2表达上升，MDR1表达下降，CDR1基因表达无明显差异。亲本株SC5314与回复株RE1之间外排泵基因CDR1、CDR2、MDR1在mRNA水平的表达均无明显差异（P>0.05）。
　　4. ADH1缺失株EX2、亲本株SC5314、回复株RE1的线粒体膜电位荧光比值分别为7.93、12.84、11.47，其中缺失株EX2较亲本株SC5314及回复株RE1线粒体膜电位均降低(P<0.05)，亲本株SC5314与回复株RE1线粒体膜电位无明显差异(P>0.05)。
　　5. ADH1缺失株EX2、亲本株SC5314、回复株RE1细胞内ATP水平分别为374.51 nM、568.82 nM、517.94 nM，缺失株EX2细胞内ATP水平较亲本株SC5314和回复株RE1均降低（P<0.05），亲本株SC5314与回复株RE1的细胞内ATP水平无明显差异（P>0.05）。
　　结论:ADH1基因可能是参与白念珠菌对氟康唑耐药的基因，其机制可能与通过影响细胞内ATP水平及线粒体膜电位，进而上调外排泵基因MDR1表达，影响外排泵功能有关。

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前言

1白念珠菌的感染耐药及治疗现状

2 白念珠菌对唑类药物的耐药机制

3 ADH1基因及其耐药性相关研究现状

4 本实验的研究思路方法，意义以及创新性

第一部分 白念珠菌ADH1缺失株对氟康唑的敏感性研究

前言

1 材料与方法

2 实验结果

3 讨论

4小结

第二部分 白念珠菌ADH1基因缺失后对外排泵及能量代谢的影响

前言

1 材料与方法

2实验结果

3 讨论

4 小结

全文讨论

结论

缩略词表

参考文献

附录

致谢