白念珠菌CDR1、CDR2和MDR1基因高表达形成的耐药与凋亡的关系

摘要

目的: 近年来全球真菌病的发病率急剧上升，其中白念珠菌(Candida albicans)的感染占据首要地位，且临床上白念珠菌对氟康唑等唑类药物的耐药日益严重，药物外排泵基因CDR1、CDR2和MDR1高表达是最主要的耐药机制之一，本研究主要探讨上述基因高表达形成的白念珠菌氟康唑耐药和凋亡的关系及相互作用机制。 方法: 1.以4株白念珠菌CDR1和CDR2基因高表达株DSY296和其亲本株DSY294，以及MDR1基因高表达株DSY292和其亲本株DSY290为研究对象，用氟康唑（fluconazole，FLC）单独或联合汉防己甲素(tetrandrine，TET)处理，设立空白对照组。 2.应用MTT法检测CDR1和CDR2基因高表达株、MDR1基因高表达株和对应亲本株之间细胞生长抑制率的差异，应用Annexin V-FITC和碘化丙啶(propidium iodide，PI)双染色法测定细胞凋亡率的差异。 3.通过流式细胞术检测细胞内活性氧（reactive oxygn species，ROS），JC-1染色测定线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential，ΔΨm），通过激光共聚焦显微镜检测metacaspase依赖型凋亡途径中的核心蛋白酶metacaspase活性，以观察ROS生成对激活metacaspase作用的影响。 4.通过qRT-PCR检测氧化应激相关基因(CAP1、GRP2)、ROS清除相关基因（SOD2、SOD5)和metacaspase编码基因(MCA1)在mRNA水平的表达差异。 结果： 1.FLC对高表达株DSY296和亲本株DSY294的MIC80分别为64μg/mL和0.25μg/mL，对高表达株DSY292和亲本株DSY290的MIC80分别为128μg/mL和0.5μg/mL；与FLC作用相比，FLC+TET对高表达株DSY296和亲本株DSY294的MIC80分别下降了9个和2个浓度梯度，高表达株DSY292和亲本株DSY290则分别下降了7个和3个浓度梯度。 2.在FLC作用下，各菌株的细胞凋亡率均增加（P＜0.05），高表达株细胞凋亡率的增加比其亲本株少，其中高表达株DSY296和亲本株DSY294分别增加了2.61%和15.87%，高表达株DSY292和亲本株DSY290分别增加了3.64%和13.44%；与FLC作用相比，FLC+TET作用下，各菌株的细胞凋亡率显著增加(P＜0.05)，高表达株细胞凋亡率的增加比其亲本株明显，其中高表达株DSY296和亲本株DSY294分别增加了23.87%和14.66%，高表达株DSY292和亲本株DSY290分别增加了17.84%和15.63%；同时，在FLC+TET作用的基础上再加metacaspase抑制剂Z-YVAD-FMK后，各菌株细胞凋亡率均减少（P＜0.05）。 3.在FLC作用下，各菌株细胞内ROS生成均升高（P＜0.05），高表达株的升高比其亲本株少；与FLC作用相比，FLC+TET作用下，各菌株细胞内ROS显著增加（P＜0.05），高表达株的升高比其亲本株明显，高表达株DSY296和亲本株DSY294的ROS生成分别升高了3.40倍和1.33倍，高表达株DSY292和亲本株DSY290升高了4.26倍和2.04倍。 4.在FLC作用下，各菌株膜电位均下降（P＜0.05），高表达株的下降比其亲本株少；与FLC作用相比，FLC+TET作用下，各菌株膜电位显著下降（P＜0.05），高表达株的下降比亲本株明显，高表达株DSY296和亲本株DSY294膜电位分别下降了41.44%和29.86%，高表达株DSY292和亲本株DSY290分别下降了35.65%和26.99%。 5.激光共聚焦显微镜观察到FLC作用下，各菌株均出现少量metacaspase激活，高表达株较其亲本株略少；在FLC+TET作用下，各菌株细胞内metacaspase激活显著增多，高表达株与其亲本株无差异。 6.在FLC作用下，各菌株CAP1、GRP2和MCA1基因在mRNA水平相对表达量上调，而SOD2和SOD5基因则下调（P＜0.05），且高表达株中CAP1、GRP2和MCA1基因的上调程度，以及SOD2和SOD5基因的下调程度均比亲本株低；与FLC作用相比，在FLC+TET作用下，各菌株CAP1、GRP2及MCA1在mRNA水平的相对表达量显著上调，而SOD2和SOD5基因则显著下调（P＜0.05），且高表达株中CAP1、GRP2及MCA1基因的上调程度，以及SOD2和SOD5基因的下调程度均比亲本株明显。 结论: 白念珠菌CDR1、CDR2和MDR1基因高表达形成的FLC耐药可以通过抑制ROS介导的metacaspase依赖型凋亡途径减少凋亡，且能被TET通过相同的途径促进其凋亡，从而逆转耐药。

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摘 要

Abstract

目 录

前 言

1 白念珠菌对唑类药物耐药的现状及机制

2 白念珠菌凋亡的相关性研究

4 汉防己甲素（TET）简介以及作为唑类药物增效剂的相关研究

5 本研究思路设计，意义以及创新性

第一部分 白念珠菌CDR1、CDR2和MDR1基因高表达形成的氟康唑耐药与凋亡关系及作用机制

前 言

1.2 主要试剂

2.1 菌株的保存与活化

2.2 菌悬液配制

2.3 MTT法测定FLC对白念珠菌细胞的生长抑制作用

2.8.2 RNA提取物的鉴定

2.8.3 去除基因组DNA和cDNA的合成

2.8.4 实时荧光定量RT-PCR

3 结 果

4 讨 论

5 小 结

第二部分 汉防己甲素对氟康唑促进白念珠菌凋亡的增效作用

前 言

已知白念珠菌对FLC等唑类抗真菌药物耐药的产生与药物外排泵对药物的外排功能增强密切相关，并且本课题组前期研究证实TET对FLC等抗白念珠菌具有逆转耐药的作用，这与其抑制白念珠菌药物外排泵基因CDR1、CDR2及MDR1的表达，抑制外排泵对药物的外排作用密切相关。因此，为了进一步确定白念珠菌药物外排泵CDR1、CDR2和MDR1基因高表达形成的耐药对白念珠菌凋亡影响，我们加入TET，抑制以上基因的的高表达后，观察两组菌株之间白念珠菌凋亡情况是否发生改变，以及潜在作用机制。

1材 料

2.1 MTT法测定FLC联合TET作用对白念珠菌细胞的生长抑制作用

3 结 果

4 讨 论

4 小 结

结 论

缩略词表

参考文献

附 录

致 谢