线粒体通路在夏枯草诱导人甲状腺乳头状癌细胞凋亡中的作用初探

摘要

甲状腺癌是人体内分泌系统最常见，也是近年来上升速度最快的恶性肿瘤之一，严重威胁人类健康。目前甲状腺癌的治疗以外科手术为主，但术后仍有复发和转移的风险。本课题组前期研究发现，经口给予夏枯草(Prunella vulgaris L.)干粉两年，大鼠甲状腺肿瘤的发生率显著降低。传统医学显示夏枯草作为一味常用的软坚散结的中草药应用于甲状腺疾病的防治已有两千年的历史。现代医学研究发现夏枯草临床治疗甲状腺肿疗效显著，但作用机制尚未了解。因此，本研究拟选用甲状腺癌中发病率最高的病理类型人乳头状癌细胞K1为试验对象，探索夏枯草诱导细胞凋亡作用及线粒体通路在其中的可能作用，为夏枯草临床应用于甲状腺肿瘤的防治提供科学依据。 目的： 探索夏枯草诱导人甲状腺乳头状癌细胞的凋亡作用及线粒体通路在其中的可能作用，为夏枯草的临床应用提供科学依据。 方法： 1.受试物及处理方法 受试物为夏枯草浸膏，采用传统水提醇沉再浓缩的方法制备，每6.95g夏枯草药材可提取1g夏枯草浸膏。称取适量夏枯草浸膏以灭菌水溶解配置成400mg/ml夏枯草溶液，经22μm孔径滤膜过滤后于4℃冰箱冷藏储存。 2.细胞株 正常人甲状腺滤泡上皮细胞（HUM-CELL-0097）、人甲状腺乳头状癌细胞（K1）。 3.实验方法 3.1 细胞培养 HUM-CELL-0097细胞培养于EpiCM4101完全培养液中，K1细胞培养于含10%澳洲胎牛血清RPMI-1640培养液中，以上两种细胞均在温度37℃，相对湿度95%，含5%CO2的细胞培养箱中培养。 3.2 研究内容 3.2.1 夏枯草对人甲状腺滤泡上皮细胞毒性作用研究 设对照组（未加夏枯草处理）和夏枯草处理组（2、5、10、20、40、80、160和200mg/ml），处理时间为24h，观察夏枯草对细胞的毒性作用，计算半数抑制浓度(50%inhibitory concentration，IC50)。 3.2.2 夏枯草对人甲状腺乳头状癌细胞毒性作用研究 设对照组（未加夏枯草处理）和夏枯草处理组（2、5、10、20、40、80、160和200mg/ml），处理时间为24h，观察夏枯草对细胞的毒性作用，并计算IC50值；然后设1/8、1/4、1/2、1和2IC50共五个剂量组，观察夏枯草对细胞形态学改变的影响。 3.2.3 夏枯草诱导人甲状腺乳头状癌细胞凋亡效应研究 设对照组（未加夏枯草处理）和夏枯草处理组（1/8、1/4、1/2、1和2IC50共五个剂量组），处理时间为24h，采用Hoechst法和流式细胞术观察夏枯草对K1细胞凋亡的影响。 3.2.4 线粒体通路在夏枯草诱导人甲状腺乳头状癌细胞凋亡作用机制研究 设对照组（未加夏枯草处理）和夏枯草处理组（1/8、1/4、1/2、1和2IC50共五个剂量组），处理24h，通过流式细胞术观察不同剂量夏枯草干预K1细胞后线粒体膜电位的变化；设对照组（未加夏枯草处理）和夏枯草处理组（1/2、1和2IC50共三个剂量组），处理24h，采用Western Blotting技术检测不同剂量夏枯草干预下乳头状癌细胞线粒体凋亡通路相关蛋白（Bcl-2、Bax、Cyto C、Caspase-9、Caspase-3、Cleaved Caspase-3）表达水平的变化。 3.3 观察指标和检测方法 细胞毒性观察采用MTT法，倒置显微镜观察细胞形态。 凋亡效应观察采用Hoechst染色法、流式细胞术。 凋亡线粒体通路机制：采用流式细胞术检测线粒体膜电位，通过Western Blotting检测Bcl-2/Bax/Cyto C/Caspase-9/Caspase-3/CleavedCaspase-3蛋白表达水平。 结果： 1.夏枯草对人甲状腺滤泡上皮细胞的细胞毒性作用 夏枯草作用24h，当剂量低于10mg/ml时对甲状腺滤泡上皮细胞生长起促进增殖作用，而高于10mg/ml时则表现为明显的抑制作用，获得夏枯草对甲状腺滤泡上皮细胞24h的IC50值为12.908mg/ml。 2.夏枯草对人甲状腺乳头状癌细胞的细胞毒性作用 2.1 细胞毒性 夏枯草作用24h，随着剂量的增加，K1细胞的增殖率逐渐降低。自2mg/ml夏枯草剂量起，与对照组比较，细胞增殖率的差异具有统计学意义(P＜0.05)，获得夏枯草对甲状腺乳头状癌细胞24h的IC50值为2.427mg/ml。 2.2 细胞形态 正常K1细胞呈卵圆形，贴壁能力强。与对照组相比，1.2mg/ml夏枯草处理组K1细胞贴壁数目明显减少，细胞变圆、出泡，胞质密度不均；2.4和4.8mg/ml夏枯草处理组大部分细胞脱落、破裂，失去细胞形态。 3.夏枯草诱导人甲状腺乳头状癌细胞的凋亡效应研究 3.1 Hoechst染色法观察细胞凋亡 与对照组相比，2.4和4.8mg/ml夏枯草作用K1细胞24h，出现致密浓染亮蓝色细胞增加，发生核固缩现象的凋亡细胞增多。 3.2 流式细胞术观察细胞凋亡 2.4和4.8mg/ml的夏枯草作用24h，K1细胞的凋亡率（包括早期凋亡率、晚期凋亡率和总凋亡率）与对照组相比显著增加。以夏枯草剂量对细胞总凋亡率进行线性回归分析，回归方程为Y=-2.120+9.086X，R2=0.893。 4.线粒体通路在夏枯草诱导人甲状腺乳头状癌细胞凋亡中的作用研究 4.1 线粒体膜电位 0.6、2.4和4.8mg/ml夏枯草作用K1细胞24h，与对照组相比，细胞线粒体膜电位显著降低(P＜0.05)。 4.2 线粒体凋亡相关蛋白表达 与对照组相比，夏枯草处理组抗凋亡蛋白Bcl-2表达减少，凋亡蛋白Bax表达增多，线粒体毒性损伤分子Cyto C表达显著增加；Caspase-9和Caspase-3原蛋白在夏枯草作用下表达水平减少，但活化的Caspase-3(Cleaved Caspase-3)蛋白表达水平增加。 结论： 1.夏枯草对人甲状腺滤泡上皮细胞和人甲状腺乳头癌细胞作用24h的IC50值分别为12.908和2.427mg/ml，表明本研究试验剂量对正常夏枯草甲状腺滤泡上皮细胞具有较好的安全性。 2.本试验条件（2.4和4.8mg/ml）下夏枯草可诱导人甲状腺乳头状癌细胞凋亡。 3.夏枯草可能通过激活线粒体通路诱导人甲状腺乳头状癌细胞凋亡。

目录

第一个书签之前