下调长链非编码RNAPVT1和MINCR对Raji细胞增殖的影响及其机制的研究

摘要

目的： 筛选靶向抑制长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）人浆细胞瘤多样异位基因1（plasmacytoma variant translocation1，PVT1）表达的小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA），探讨下调PVT1的表达对B淋巴瘤细胞Raji增殖的影响及其机制，并研究同时下调PVT1和MYC诱导的长链非编码RNA（MYC-induced long noncoding RNA，MINCR）是否可增强对Raji细胞增殖的抑制作用。 方法： 第一部分：设计合成针对PVT1的siRNA1、2、3、4（位点分别为54、176、845、1055）及无关对照siRNA(scramble control siRNA,SC-siRNA)序列。实验分为siRNA1组、siRNA2组、siRNA3组、siRNA4组、SC-siRNA组、空转组和细胞组。利用HiperFect转染试剂将各条siRNA转染到Raji细胞中，用流式细胞仪检测转染效率，分别用RT-PCR、CCK8、流式细胞仪、Western blotting检测细胞中PVT1的相对表达水平、细胞增殖情况、细胞周期和c-Myc蛋白的表达。 第二部分：合成针对MINCR的siRNA，将MINCR-siRNA和PVT1-siRNA4分别和联合转染至Raji细胞，实验分为PVT1-siRNA组、MINCR-siRNA组、PVT1-siRNA+MINCR-siRNA组（联合组）、SC-siRNA组和细胞组。用RT-PCR检测细胞中MINCR的相对表达水平，而后分别用CCK8、流式细胞仪、Western blotting检测各组细胞增殖情况、细胞周期和c-Myc蛋白的表达。 第三部分：由上海吉凯基因化学技术有限公司协助构建和包装携带靶向PVT1的短发夹RNA（small hair RNA，shRNA）的重组慢病毒颗粒（LV-PVT1-shRNA）和阴性对照慢病毒颗粒（negative control lentivirus，LV-NC）。将LV-PVT1-shRNA和LV-NC分别转染至Raji细胞，用嘌呤霉素筛选单细胞克隆后扩大培养。倒置荧光显微镜观察细胞荧光表达情况，RT-PCR、CCK8、流式细胞仪分别检测转染后细胞PVT1的相对表达水平、细胞增殖活力和细胞周期。而后用细胞周期PCR芯片检测稳定表达PVT1-shRNA细胞的细胞周期相关基因的变化，再用RT-PCR和Western blotting验证部分差异表达的基因。 结果： 第一部分：将siRNA序列转染至Raji细胞后，细胞转染效率为（79.81±4.34）%。PVT1-siRNA4 转染到Raji细胞后PVT1表达水平下调，与SC-siRNA组、空转组和细胞组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。siRNA1组、siRNA2组和siRNA3组PVT1表达水平与SC-siRNA组、空转组和细胞组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。PVT1-siRNA4转染Raji细胞后细胞增殖抑制率增高，G1期细胞比例增加，与SC-siRNA组、空转组和细胞组相比均有统计学差异（P＜0.05）；PVT1-siRNA4转染Raji细胞后c-Myc蛋白表达水平下降，与SC-siRNA组、空转组和细胞组相比有统计学差异（P＜0.05）。 第二部分：MINCR-siRNA转染Raji细胞后MINCR RNA表达水平降低，与SC-siRNA组和细胞组相比有统计学差异（P＜0.05）。MINCR-siRNA转染后细胞增殖抑制率增加，与SC-siRNA组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。联合PVT1-siRNA后增殖抑制率增加更明显，与PVT1-siRNA组、MINCR-siRNA组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。MINCR-siRNA转染Raji细胞后G1期细胞比例增加，与SC-siRNA组和细胞组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。联合PVT1-siRNA后G1期阻滞更加明显，与PVT1-siRNA组、MINCR-siRNA组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。MINCR-siRNA转染Raji细胞后c-Myc蛋白表达水平下降，与SC-siRNA组和细胞组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。联合PVT1-siRNA后下降更明显，与PVT1-siRNA组、MINCR-siRNA组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。 第三部分：①成功筛选出稳定表达PVT1-shRNA的Raji细胞株。用倒置荧光显微镜观察大部分细胞携带绿色荧光。转染PVT1-shRNA后细胞PVT1表达水平明显下调，与LV-NC组和未转染细胞组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。LV-PVT1-shRNA组细胞增殖能力下降，G1期细胞比例增多，与LV-NC组和未转染细胞组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。②PCR芯片检测稳定表达PVT1-shRNA的Raji细胞的细胞周期相关基因的变化，结果显示LV-PVT1-shRNA组与LV-NC组相比，有54个基因上调，26个基因下调。以两组相差1.5倍以上为差异表达，其中上调的差异基因有31个，下调的差异基因有8个。PCR验证结果显示CCNG2、RBL2、CDKN1A、HUS1、CDKN3、CDKN1B在LV-PVT1-shRNA组中表达都上调，与LV-NC组和未转染细胞组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。CCNE1、CCND1在LV-PVT1-shRNA组中表达都下调，与LV-NC组和未转染细胞组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。CDC20在LV-PVT1-shRNA组中表达稍微下降，但与LV-NC组和未转染细胞组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。Western blotting验证结果显示LV-PVT1-shRNA组p21表达增加，CCNE1表达下降，与LV-NC组和未转染细胞组相比差异均有统计学意义（P＜0.05）。这些基因上下调的趋势与PCR芯片结果一致。 结论： 1.PVT1的表达下调可能通过抑制细胞周期G1期进展而抑制Raji细胞增殖。 2.同时下调PVT1和MINCR可增强对Raji细胞增殖的抑制作用。 3.PVT1下调后，Raji细胞增殖抑制主要与c-Myc蛋白表达降低及细胞周期相关基因的表达改变（如p21表达上调、CCNE1表达下调）相关。

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