扁蒴藤素在葡萄膜黑色素瘤细胞中抗肿瘤活性及其机制研究

摘要

葡萄膜黑色素瘤是成人眼内最常见的恶性肿瘤。迄今为止，临床上尚无有效的靶向治疗药物。在过去的数十年间，葡萄膜黑色素瘤病人的生存和预后没有明显改善。NF-κB信号通路在肿瘤的发生和发展中发挥着重要作用；同时，NF-κB在葡萄膜黑色素瘤细胞中处于异常激活的状态，因此，它可能成为治疗葡萄膜黑色素瘤的一个潜在靶点。扁蒴藤素作为一种NF-κB抑制剂，在多种恶性肿瘤中都具有良好的抗肿瘤活性，但其在葡萄膜黑色素瘤中是否有效还尚不清楚。因此，我们将探究扁蒴藤素对葡萄膜黑色素瘤细胞的生物学效应及其作用机制。 采用双荧光素酶报告基因实验，免疫荧光和Western blotting研究扁蒴藤素对葡萄膜黑色素瘤细胞中经典的NF-κB信号通路的影响；MTS和软琼脂克隆形成实验检测其对葡萄膜黑色素瘤细胞增殖的影响；流式细胞术分析其对细胞凋亡和细胞周期的作用；Western blotting检测相关蛋白的表达水平；细胞划痕和Transwell实验检测其对细胞迁移和侵袭的影响；肿瘤球形成及传代实验和流式细胞术分析ALDH+细胞亚群比例等评价其对葡萄膜黑色素瘤肿瘤干细胞的作用。 实验结果显示，扁蒴藤素能够抑制葡萄膜黑色素瘤细胞中肿瘤坏死因子α诱导的IκBα的磷酸化及降解，核因子p65核易位和NF-κB靶基因的表达，提示其能够抑制经典的NF-κB信号通路的激活。此外，扁蒴藤素能够显著降低葡萄膜黑色素瘤细胞（92.1、Mel270、Omm1和Omm2.3）的细胞活力和克隆形成能力，诱导G0/G1期细胞周期阻滞。Annexin V/PI双染的流式结果显示扁蒴藤素呈剂量和时间依赖性诱导葡萄膜黑色素瘤细胞发生细胞凋亡；Western blotting的结果显示其能够引起Caspase-3的活化和PARP的切割。CMXRos和MTGreen双染流式细胞术分析发现扁蒴藤素能够引起线粒体膜电位的降低，导致细胞色素C的释放，提示扁蒴藤素可能是通过线粒体途径诱导细胞发生凋亡。通过对凋亡相关蛋白检测发现，扁蒴藤素能够显著降低葡萄膜黑色素瘤细胞中抗凋亡蛋白Survivin的表达，挽救实验的结果显示，在Omm1细胞中过表达Survivin导致Omm1细胞对扁蒴藤素的敏感性降低；相反，在92.1细胞中敲低Survivin的表达能够明显增强了92.1细胞对扁蒴藤素的敏感性，提示Survivin可能在扁蒴藤素诱导的细胞凋亡中发挥了重要作用。机制研究发现扁蒴藤素可能是在转录水平上调控Survivin的表达。细胞划痕和Transwell实验结果显示，扁蒴藤素通过基质金属蛋白酶MMP2和MMP9显著抑制Omm1和92.1细胞的迁移和侵袭。更重要的是，我们观察到扁蒴藤素能够显著减少葡萄膜黑色素瘤细胞中ALDH+亚群细胞的比例和抑制其肿瘤干细胞的自我更新，降低肿瘤干细胞相关蛋白Slug和Sox2的表达。扁蒴藤素与临床一线用药长春碱联合使用时，具有协同抑制葡萄膜黑色素瘤细胞增殖和诱导细胞凋亡的作用。 综上所述，扁蒴藤素能够阻断葡萄膜黑色素瘤细胞中经典的NF-κB信号通路的激活，抑制葡萄膜黑色素瘤细胞的增殖、诱导细胞凋亡、抑制其迁移和侵袭、有效杀伤葡萄膜黑色素瘤细胞肿瘤干细胞亚群、与长春碱具有协同抗肿瘤的作用。以上结果为扁蒴藤素在葡萄膜黑色素瘤病人的临床试验提供了有力证据。

目录

声明

英文缩略词

1前言

1.1葡萄膜黑色素瘤

1.2 NF-κB信号通路

1.3 扁蒴藤素

1.4 科学问题

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 细胞系

2.1.2 主要仪器和设备

2.1.3 主要试剂

2.1.4 抗体

2.1.5 主要溶液与配制

2.2 实验方法

2.2.1 细胞培养

2.2.2 荧光素酶报告基因实验

2.2.3 免疫荧光

2.2.4 胞浆和胞核蛋白提取

2.2.5 Western blotting

2.2.6 MTS法测定细胞活力

2.2.7 软琼脂克隆形成实验

2.2.8 流式细胞术检测细胞周期

2.2.9 Annexin V-FITC/PI双染法测定细胞凋亡

2.2.10 CMXRos和MTGreen双荧光探针法检测线粒体膜电位

2.2.11 线粒体外胞浆蛋白和线粒体蛋白的提取

2.2.12 慢病毒感染

2.2.13 总RNA提取

2.2.14 实时荧光定量PCR

2.2.15 划痕实验

2.2.16 细胞迁移/侵袭实验

2.2.17 乙醛脱氢酶实验

2.2.18 肿瘤球传代培养

2.2.19 统计分析

3 实验结果

3.1 PST阻断UM细胞中TNFα介导的NF-κB信号通路的激活

3.2 PST抑制UM细胞的生长

3.3 PST诱导UM细胞发生凋亡

3.4 Survivin在PST诱导的UM细胞凋亡中发挥着重要作用

3.5 PST抑制UM细胞的迁移和侵袭

3.5 PST能够杀伤UM中的肿瘤干细胞

3.6 PST能够增强UM细胞对长春碱的敏感性

4 讨论

5 结 论

6 总结与展望

参考文献

研究生期间发表论文情况

致谢