脐带间充质干细胞来源的条件培养基对退变椎间盘髓核来源干/祖细胞再生能力的影响

摘要

目的: 越来越多的证据表明植入间充质干细胞（MSCs）的治疗作用不是干细胞本身而是其分泌的营养因子和细胞因子介导的。本文从退变髓核和脐带组织中高效分离培养出MSCs，并对细胞的生物学特征进行鉴定和比较。进一步从细胞外形、细胞表型、细胞增殖能力、三系分化潜能、细胞多能性及髓核特别标志基因表达等方面去评估人脐带间充质干细胞来源的条件培养基(UCMSCs-CM)对退变椎间盘髓核干细胞/祖细胞(D-NPMSCs)再生能力的影响。 方法: 采用酶解组织块法分离提纯人退变椎间盘髓核来源的细胞，采用组织块贴壁法分离提纯人脐带间充质干细胞(UCMSCs)，然后进行贴壁扩增培养至P3代并观察细胞的形态学特征。采用流式细胞术验证细胞MSC表面标志物的特征，比较分析MSC表面标志物的阳性细胞率，并对它们进行三系分化能力鉴定及比较。 收集UCMSCs的条件培养基体外作用D-NPMSCs，观察D-NPMSCs的形态学变化。进一步采用流式细胞术检测MSCs和NP细胞的表面特异性标志物、以及细胞凋亡和细胞周期的表达。通过生长曲线分析、CCK8和EdU评估D-NPMSCs细胞活力和增殖能力。通过特异的细胞化学染色法测定D-NPMSCs的多向分化潜能。通过qRT-PCR分析NP特异标记物和多能性相关基因的mRNA表达。通过western blot初步探讨了UCMSCs-CM对D-NPMSCs的ERK磷酸化水平的影响。 结果： 在体外培养退变NPSCs的体系中加入人UCMSCs条件培养液，结果显示D-NPSCs的外形发生了明显改变，纺锤梭形细胞比例明显增加。通过流式细胞术，发现间充质干细胞特异性表面抗原表达水平明显上调；增殖能力显著提高，而处于分裂S期的细胞明显增多，凋亡细胞显著减少。D-NPMSCs的成骨和成软骨分化潜能也显著增强。此外发现经UCMSCs-CM作用后的D-NPMSCs的多能性基因(Nanog、OCT4）和NP祖细胞标志基因Tie2表达量显 著上调，然而NP细胞特别标志物(ACAN、COL2A1、SOX9、CD24)的表达量显著下调。最后，发现经UCMSCs-CM作用后的D-NPMSCs的ERK的磷酸化水平明显降低。 结论： 研究表明，人脐带间充质干细胞来源的条件培养基可以通过改善退变椎间盘髓核干/祖细胞的增殖能力、干性以及成骨和成软骨分化潜能提高退变髓核细胞的再生能力。本研究为发展基于干细胞的椎间盘退变治疗策略提供了见解和观点。

目录

声明

第一章 前言

1.椎间盘结构

2.椎间盘退变及病因

3.椎间盘退变的治疗策略

4.基于UCMSCs治疗的旁分泌机制

5.本课题的研究思路

第二章 退变椎间盘组织髓核干/祖细胞与脐带来源间充质干细胞生物学特性的比较

1. 引言

2．实验材料

3.实验方法

5.实验结果

6.讨论

7.小结

第三章 UCMSCs-CM对退变椎间盘髓核来源干/祖细胞再生能力的影响

1.引言

2.实验材料

3.实验方法

4.数据分析

5.实验结果

6.讨论

7.小结

全文总结

1.文中主要小结

2.本课题的特色和创新

3.实验欠缺与不足

参考文献

中英文缩写词

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致谢