E3连接酶Nrdp1调控巨噬细胞极化对成纤维细胞功能的影响

摘要

增生性瘢痕是烧伤、外伤、手术等创伤所致的常见并发症，其病理特征表现为成纤维细胞大量增殖及细胞外基质异常沉积。转化生长因子β1（transforming growth factor-beta1，TGF-β1）是目前公认最重要的促纤维化细胞因子，它参与炎症、细胞增殖、生长、分化以及调节细胞外基质的沉积，是一类具有多种功能的细胞因子，TGF-β1通过细胞内信号转导通路在增生性瘢痕形成过程中发挥重要作用。同时，胶原蛋白的大量合成及Ⅰ、Ⅲ型胶原纤维比例改变同样是增生性瘢痕形成的重要机制，Ⅰ型胶原增多是形成增生性瘢痕的重要原因之一。几乎所有的创伤修复过程都要经历炎症阶段，巨噬细胞是炎症反应过程中的重要免疫细胞，在机体免疫防御中有重要作用，它可在不同的外部刺激下活化为不同的亚型，主要有经典激活途径（classical activation，M1）及替代激活途径（alternative activation，M2），而M2型巨噬细胞是TGF-βs的重要来源，在肾间质中M2型巨噬细胞可分泌TGF-β1。近期研究表明，M2型巨噬细胞通过细胞募集，分泌细胞因子与调控代谢等层面参与了纤维化疾病的发生发展。新近发现的E3泛素连接酶Nrdp1（neuregulin receptor degradation protein1），其通过泛素化调控，介导了巨噬细胞M2型极化。因此，本项目提出“Nrdp1泛素化介导巨噬细胞M2型极化，影响成纤维细胞的功能，参与了增生性瘢痕的形成”假说。体外构建成纤维细胞与巨噬细胞共培养体系，通过siRNA-Nrdp1靶向干预，研究巨噬细胞极化对成纤维细胞促纤维化因子分泌能力的作用；探讨巨噬细胞极化对成纤维细胞增殖、胶原分泌等功能的影响。为探索瘢痕的发病机制开拓新思路，并为靶向免疫调节治疗增生性瘢痕提供理论基础。 目的： 探讨Nrdp1调控巨噬细胞极化对成纤维细胞功能的影响 方法： （1）体外组织块法培养小鼠真皮成纤维细胞，提取小鼠原代腹腔巨噬细胞；（2）以LPS（100ng/ml）和IFN-γ（20ng/ml）联合诱导原代腹腔巨噬细胞为M1型巨噬细胞，以IL-13（10ng/ml）诱导巨噬细胞为M2型巨噬细胞；（3）24h后流式细胞术检测M1型巨噬细胞表面标记蛋白CD11c及M2型巨噬细胞表面标记蛋白CD206；（4）Western blot检测M1型巨噬细胞特异性产物诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、M2型巨噬细胞特异性产物精氨酸酶1（Arg1）表达情况；（5）瞬时转染siRNA-Nrdp1，以Western blot检测Nrdp1表达，观察干扰效果；（6）不同诱导作用条件下的巨噬细胞和成纤维细胞在Transwell培养体系下共培养8h、12h以及24h，实验分为LPS组（代表LPS及IFNγ共同诱导）、LPS-NC组（siRNA阴性对照组）、LPS-siRNA-Nrdp1组、IL13组、IL13-NC组、IL13-siRNA-Nrdp1组；（7）CCK8检测不同培养条件下成纤维细胞增殖情况；（8）ELISA检测不同培养时间下细胞上清液TGF-β1、Ⅰ型前胶原含量。 结果： （1）流式细胞术检测LPS联合IFN-γ诱导的巨噬细胞，通过检测M1型表面标记蛋白CD11c，发现阳性细胞比例从70.46%±5.60%增加至89.30%±2.52%（P＜0.05）；IL13诱导的巨噬细胞，检测M2型表面标记蛋白CD206，阳性细胞比例从7.23%±2.57%增加至36.66%±15.56%（P＜0.05）；（2）Western blot检测M1型特异性产物iNOS，发现LPS联合IFN-γ诱导组目的蛋白iNOS表达量高于对照组（P＜0.01）及IL-13诱导组（P＜0.01）；对于M2型特异性产物Arg1，IL13诱导组目的蛋白表达高于未诱导组及LPS（P＜0.01）及LPS联合IFN-γ诱导组（P＜0.01）；（3）siRNA-Nrdp1干扰巨噬细胞24h后，Western blot检测结果显示，Nrdp1的蛋白表达明显低于空白对照组（P＜0.01）及阳性对照组（P＜0.01）；（4）CCK8检测结果显示，8h各实验组无统计学差异（P＞0.05）；共培养12h时，IL13-siRNA-Nrdp1组低于IL13组、IL13-NC组（P＜0.05）；共培养达24h时，IL13-siRNA-Nrdp1组明显低于IL13组及IL13-NC组（P＜0.01）；（5）ELISA检测8h、12h、24h各共培养体系上清液TGF-β1、Ⅰ型前胶原含量，在TGF-β1表达上，8h各实验组无统计学差异（P＞0.05）；共培养达12h时，IL13-NC组的TGF-β1表达量低于IL13组（P＜0.05），共培养达24h时IL13-siRNA-Nrdp1组TGF-β1明显低于IL13组及IL13-NC组（P＜0.01）；在Ⅰ型前胶原含量变化上，共培养8h时IL13-siRNA-Nrdp1组低于IL13组（P＜0.05）；12h时IL13-siRNA-Nrdp1组明显低于IL13组（P＜0.01）；24时IL13-siRNA-Nrdp1组明显低于IL13组。 结论： 1．LPS联合IFN-γ可诱导巨噬细胞向M1型极化，IL-13可诱导巨噬细胞向M2型极化； 2．通过siRNA干扰Nrdp1合成调控巨噬细胞向M2型极化，可抑制共培养体系中成纤维细胞的增殖。 3．通过siRNA干扰Nrdp1的合成从而减少M2型巨噬细胞生成，可减少共培养体系中成纤维细胞TGF-β1分泌量； 4．通过siRNA干扰Nrdp1的合成从而影响M2型巨噬细胞极化，可减少共培养体系中成纤维细胞Ⅰ型前胶原的产生.

目录

声明

第一章 前言

1 实验动物、试剂、耗材及仪器

1.1 实验动物

1.2 实验试剂

1.3实验耗材25cm2培养瓶

1.4主要溶剂的配制10%高糖培养基

1.5实验耗材

2 实验方法

2.1 小鼠真皮成纤维细胞培养

2.2 小鼠腹腔巨噬细胞的培养

2.3 M1、M2型巨噬细胞的诱导

2.4 Nrdp1-siRNA干扰

2.5蛋白质印迹法（WesternBlot）检测Arg-1、iNOS、Nrdp1表达

2.7 CCK8检测成纤维细胞活力

2.8 ELISA检测TGF-β1、proCollagen-I

2.9 统计学处理

第三章实验结果

1. 成纤维细胞及腹腔巨噬细胞形态

2．巨噬细胞诱导后鉴定

2．1流式细胞术检测巨噬细胞表面标记蛋白

2.2 Western Blot检测巨噬细胞亚型M1、M2特异性产物

3.siRNA-Nrdp1抑制M1、M2相关基因的表达

4.ELISA检测共培养体系上清液TGF-β1、procollagenⅠ表达

4.1 ELISA检测各组不同时段共培养体系上清液TGF-β1表达情况

4.2 ELISA检测各组不同时段共培养体系上清液procollagenⅠ表达情况

5.CCK8检测成纤维细胞活力

第四章 讨论

1.Nrdp1调控巨噬细胞极化影响成纤维细胞分泌TGFβ1

2. si-Nrdp1对共培养体系中成纤维细胞增殖状态的影响

3. siRNA-Nrdp1对共培养体系中成纤维细胞Ⅰ型前胶原分泌的影响

第五章 结论

参考文献

中英文缩略词对照表

攻读期间所获成果

致谢