野葛内生菌抗氧化及抗衰老作用的研究

摘要

研究已经证实氧化特别是氧自由基与高等动物许多疾病的发生、发展以及衰老密切相关，天然抗氧化剂在医药卫生、食品、化妆品以及饲料等领域有巨大的应用前景。植物内生菌是新型天然生物活性物质研究开发的重要资源。本论文开展野葛内生菌抗氧化及抗衰老作用的相关研究，旨在为野葛内生菌的研究利用和新型抗氧化及抗衰老天然活性物质的研究开发提供依据。主要研究内容和结果如下：
　　 1.野葛内生菌代谢产物体外抗氧化活性的研究。采用DPPH（1，1-二苯基苦基苯肼）自由基清除法、ABTS（2，2-连氮-双（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸））自由基清除法、羟基自由基清除体系，超氧阴离子自由基清除体系、还原能力测试体系研究四株野葛内生细菌（编号分别为Nc1、Nd1、Ne2、Na2）的体外抗氧化活性。结果表明，所测试的菌株代谢产物均显示出不同程度的体外抗氧化活性。在10mg/mL的浓度下，菌株Nc1、Nd1、Ne2、Na2代谢产物粗提物对DPPH自由基清除率分别为74％、57％、82％、69％；对ABTS自由基清除率分别为80％、71％、88％、68％；对羟基自由基清除率分别为40％、95％、67％、74％；对超氧阴离子自由基清除率分别为62％、23％、54％、45％；还原能力大小依次为Nc1>Ne2>Na2>Nd1。不同浓度样品对自由基清除效果的研究结果表明，所有样品对自由基的清除率均呈现明显的量效关系。Nc1、Nd1、Ne2、Na2，对超氧阴离子自由基的50％清除率（IC50）依次为8.31 mg/mL、23.8mg/mL、9.13 mg/mL、11.1 mg/mL，对羟基自由基的50％清除率（IC50）依次为12.5 mg/mL、5.7 mg/mL、7.9 mg/mL、6.9 mg/mL。
　　 2.野葛内生菌Ne2代谢产物粗提样品对D-半乳糖致衰老加速小鼠的抗衰老作用。采用D-半乳糖致亚急性衰老法建立小鼠衰老模型，以Vc为阳性对照组，通过对小鼠体征、行为学观察、脏器系数和对防御性抗氧化酶（SOD、GSH-PX）、脂质过氧化产物（MDA）等指标的检测，测定野葛内生菌Ne2代谢产物样品低、中、高剂量组对D-半乳糖致亚急性衰老小鼠抗衰老能力的调节作用。结果表明，D-半乳糖能明显加速小鼠衰老各项体征，包括记忆和学习能力显著降低，脑组织SOD、GSH-PX含量显著降低，血清MDA含量显著增高等。与模型组比较，野葛内生菌Ne2代谢产物样品高剂量组小鼠的脑组织SOD含量提高12.5％（P<0.05）、血清GSH-PX含量提高52.3％（P<0.01）、血清MDA含量降低40.9％（P<0.01）、学习记忆能力明显提高（P<0.01）、胸腺系数提高15.5％（P<0.01）、脾系数提高13.9％（P<0.05）、心脏系数提高19.2％（P<0.01）和脑系数提高21.5％（P<0.01）。对小鼠海马组织超微结构进行观察，结果表明高剂量组D-半乳糖致衰老小鼠的细胞膜和细胞核结构损伤程度明显减轻。提示高剂量的野葛内生菌Ne2代谢产物粗提样品对细胞老化的细胞核和细胞膜具有良好的改善作用。
　　 3.野葛内生菌Ne2抗氧化活性成分AE1初步分离纯化和抗氧化研究。通过硅胶柱层析，高效液相等活性成分分离技术，对菌株Ne2的抗氧化活性组分进行分离纯化，得到一个活性组分（编号为AE1），紫外光谱扫描和高效液相色谱检测结果显示组分AE1为单一组分。对AE1进行体外抗氧化定量研究，结果显示，AE1表现出很强的自由基清除能力，其对DPPH自由基、ABTS自由基、羟基自由基、和超氧阴离子自由基的50％清除率（IC50）分别为0.2683mg/mL、0.4897mg/mL、3.776mg/mL和7.662mg/mL。

目录

文摘

英文文摘

第一章 前言

1．1 自由基与抗氧化综述

1．1．1 自由基研究概述

1．1．2 抗氧化研究概述

1．2 衰老和抗衰老的研究综述

1．2．1 衰老的研究进展

1．2．2 动物衰老模型研究

1．3 植物内生菌的研究综述

1．3．1 植物内生菌的概述和研究发展

1．3．2 植物内生菌抗氧化活性物质的研究进展

1．4 野葛的药用价值及其生物活性物质

1．5 本论文研究意义

第二章 野葛内生菌代谢产物体外抗氧化活性的研究

2．1 材料

2．1．1 供试菌种

2．1．2 主要试剂

2．1．3 主要培养基

2．1．4 主要仪器设备

2．2 试验方法

2．2．1 野葛内生菌代谢产物粗提物的制备

2．2．2 野葛内生菌代谢产物粗提物对DPPH自由基清除活性测定

2．2．3 野葛内生菌代谢产物粗提物对ABTS自由基清除活性测定

2．2．4 野葛内生菌代谢产物粗提物对超氧阴离子自由基清除活性测定

2．2．5 野葛内生菌代谢产物粗提物对羟基自由基清除活性测定

2．2．6 野葛内生菌代谢产物粗提物对还原能力测定

2．3 结果与分析

2．3．1 野葛内生菌代谢产物粗提物对DPPH自由基清除活性测定结果

2．3．2 野葛内生菌代谢产物粗提物对ABTS自由基清除活性测定结果

2．3．3 野葛内生菌代谢产物粗提物对超氧阴离子自由基清除活性测定结果

2．3．4 野葛内生菌代谢产物粗提物对羟基自由基清除活性测定结果

2．3．5 野葛内生菌代谢产物粗提物还原能力测定结果

2．4 讨论

第三章 野葛内生菌Ne2代谢产物粗提品对D—半乳糖致衰老加速小鼠的抗衰老作用

3．1 材料

3．1．1 供试菌种

3．1．2 供试样品

3．1．3 主要试剂

3．1．4 主要培养基

3．1．5 主要仪器设备

3．1．6 供试动物

3．2 实验方法

3．2．1 分组

3．2．2 造模给药

3．2．3 小鼠行为学实验

3．2．4 小鼠体征观察

3．2．5 小鼠脑组织蛋白含量测定

3．2．6 小鼠脑组织SOD含量测定

3．2．7 小鼠脑组织MDA含量测定

3．2．8 小鼠血清GSH—PX含量测定

3．2．9 脏器指数的测定

3．2．10 对小鼠脑组织海马区超微结构的观察

3．2．11 统计方法

3．3 结果与分析

3．3．1 小鼠体征观察结果

3．3．2 小鼠体重变化

3．3．3 小鼠脏器系数的影响

3．3．4 对小鼠学习速率及记忆能力的影响

3．3．5 对小鼠脑组织SOD和MDA含量影响结果

3．3．6 小鼠血清GSH—PX含量的影响结果

3．3．7 野葛内生菌Ne2代谢产物对D—半乳糖致衰老小鼠脑组织海马区超微结构的影响

3．4 讨论

第四章 野葛内生菌Ne2抗氧化活性成分AE1的分离提纯及体外抗氧化活性研究

4．1 材料

4．1．1 供试菌种

4．1．2 主要试剂

4．1．3 主要培养基

4．1．4 主要仪器设备

4．2 试验方法

4．2．1 野葛内生菌Ne2抗氧化活性成分初提样品的制备

4．2．2 野葛内生菌Ne2抗氧化活性成分硅胶柱初步分离

4．2．3 野葛内生菌Ne2抗氧化活性成分AE1的再次分离纯化

4．2．4 活性成分AE1的高效液相检测

4．2．5 野葛内生菌Ne2抗氧化活性成分AE1体外抗氧化活性测定

4．3 结果与分析

4．3．1 抗氧化活性成分AE1初步分离效果的检测及初步鉴定

4．3．2 野葛内生菌Ne2活性成分AE1体外抗氧化测定结果

4．4 讨论

小结与展望

参考文献

致谢

缩略词(Abbreviations)