蚓激酶提取工艺以及酶学性质研究

摘要

蚓激酶（Earthworm fibrinolytic enzymes，EFE）是一组具有激酶和纤溶酶活性的丝氨酸蛋白水解酶，可以作为治疗血栓类疾病的药物。本论文利用赤子爱胜蚓（Eisenia faetida）为原料，采用超滤、硫酸铵盐析，以及分子筛和离子交换层析等手段，对蚓激酶的提取工艺进行优化研究，并对提取工艺的成本进行核算。在获得了较高纯度的蚓激酶（EFE）的基础上，本论文也蚓激酶的其酶学特性展开初步研究。其主要实验结果如下：
　　 1）蚓激酶的提取工艺的优化
　　 以赤子爱胜蚓（Eisenia faetida）为原料，采用组织破碎、离心、超滤、二次硫酸铵盐析、Sephadex G-25凝胶过滤、DEAE-Cellucose-52离子交换层析的提纯步骤，分离得到蚓激酶（EFE）。酶活力检测采用纤维蛋白平板法，实验过程中对酶提取条件进行优化，选取0.1 mol/L pH7.8的磷酸缓冲溶液作为提取缓冲液，在盐析过程中分别选取35％-70％ NH4SO4分部沉淀。提取纯化的蚓激酶（EFE）经过DEAE离子交换层析，比酶活达42000 U/mg，纯化倍数达到53.8倍，酶活力回收率为3.7％。经过SDS-PAGE凝胶电泳，其相对分子量约为26 kD，含有2个亚基，每个亚基的相对分子量约为14 kD；获得二聚体，得到较高纯度的蚓激酶。
　　 2）提取工艺的成本核算
　　 本实验提取纯化的蚓激酶过程中能耗、成本支出、蚓激酶收益进行成本核算，以15000U/mg规格蚓激酶市场价6000元/kg，20000U/mg规格蚓激酶市场价12000元/kg为标准，100 kg鲜蚯蚓可生产规格为15000U/mg的蚓激酶4.2kg或者规格为20000U/mg的蚓激酶2.46kg，经过成本计算得到毛利润分别为19962.7元和24282.7元。
　　 3）以提取的蚓激酶为研究对象，对蚓激酶（EFE）的酶学性质和酶的稳定性进行了研究。来源于赤子爱胜蚓（Eisenia faetida）的蚓激酶最适温度为45℃，最适pH为7.0；在37-55℃，该酶有较好的热稳定性，但是温度高于60℃时，酶活迅速降低；在pH 7.0-9.0范围内，酶活相对稳定，说明该酶有一定的耐碱性；金属离子Hg2+对酶活有强烈的抑制作用；而Mg2+对酶有明显的激活作用；Ca2+和K+对酶活的影响不明显算。

目录

文摘

英文文摘

第一章 绪论

1.1 蚓激酶概述

1.2 蚓激酶的理化特性

1.3 蚓激酶的纤溶机理

1.3.1 蚓激酶的激酶和纤溶酶特性

1.3.2 对纤维蛋白原的降解作用及对纤溶酶原作用的研究

1.4 酶学性质

1.4.1 对合成底物作用专一性研究

1.4.2 对不同抑制剂抑制作用的研究

1.5 酶的构象

1.6 蚓激酶分离纯化

1.7 蚓激酶的应用研究

1.7.1 蚓激酶的抗凝和溶纤功能

1.7.2 毒性实验

1.7.3 蚓激酶临床应用研究

本论文的研究意义及内容

第二章 蚓激酶提取工艺研究

2.1 实验材料

2.1.1 实验材料

2.1.2 主要试剂

2.1.3 主要仪器

2.2 方法

2.2.1 蛋白标准曲线制作与蛋白含量测定

2.2.2 蚓激酶酶活力的检测方法

2.2.3 蚓激酶粗酶液的制备

2.2.4 超滤

2.2.5 硫酸铵分级沉淀

2.2.6 Sephadex G-25凝胶过滤

2.2.7 DEAE-Cellucose-52离子交换层析

2.2.8 层析柱的装柱和再生

2.2.9 ％-20％SDS-PAGE梯度电泳

2.3 结果与讨论

2.3.1 匀浆缓冲液的选择与用量的确定

2.3.2 Bradford法测定蛋白含量的标准曲线

2.3.3 纤维蛋白平板法测定酶活力标准曲线

2.3.4 超滤前后酶液成分含量的变化

2.3.5 硫酸铵分级沉淀工艺条件的确定

2.3.6 Sephadex-25凝胶过滤

2.3.7 DEAE-Cellucose-52离子交换层析

2.3.84％-20％SDS-PAGE梯度电泳

2.4 本章小结

2.4.1 分离纯化总流程

2.4.2 纯化结果

第三章 蚓激酶酶学性质的研究

3.1 实验材料

3.1.1 实验材料

3.1.2 实验试剂

3.1.3 主要仪器

3.2 方法

3.2.1 酶活测定方法

3.2.2 蚓激酶最适反应温度及热稳定性的测定

3.2.3 金属离子对酶活的影响

3.2.4 最适pH测定

3.3 结果与讨论

3.3.1 蚓激酶最适反应温度及热稳定性

3.3.2 金属离子对酶活的影响

3.3.3 最适pH值

3.4 本章小节

第四章 蚓激酶提取工艺的成本核算

4.1 产品成本概述

4.1.1 产品成本分类

4.1.2 成本计算方法

4.1.3 成本核算意义

4.2 本实验成本数据来源

4.3 蚓激酶市场价格

4.4 本实验生产得到的蚓激酶收益

4.5 成本的收支结算

4.6 本章小节

结论与展望

结论

展望

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间科研情况