兔须癣毛癣菌的鉴定及快速诊断方法的建立

摘要

兔皮肤真菌病是由皮肤癣菌引起的一类传染性很强的接触性传染病。在世界范围内广泛流行。兔须癣毛癣菌病不仅严重影响养兔业经济效益，还是人畜共患传染病，引起人皮肤真菌病，严重危害养殖生产者及公众健康。因此，对须癣毛癣菌进行准确鉴定，并建立特异，敏感的，快速的诊断方法，筛选出有效的抗真菌药物，对于养殖生产及公众健康具有重要意义。
　　采用rDNA-ITS序列分析结合真菌形态学和生理学试验对兔须癣毛癣菌进行鉴定。从疑似患兔采集皮屑样品接种沙保弱培养基，观察菌落特征及菌丝显微结构，并进行尿素酶和毛发穿孔试验。提取分离株（29株）DNA，利用引物ITS1和ITS4进行PCR扩增，扩增产物测序后在GenBank核酸数据库中进行同源性比对，结果显示，分离株的菌落形态为白色粉末状，背面有色素沉着，培养可见大量葡萄状小分生孢子，螺旋菌丝及棒状大分生孢子；尿素酶和毛发穿孔试验阳性；rDNA-ITS序列比对结果显示，分离株与须癣毛癣菌复合体中的万博节皮菌同源性在99.2％以上；从形态学和生理学试验符合须癣毛癣菌的特点，结合分子生物学试验将29株分离株鉴定为万博节皮菌。
　　利用几丁质酶基因（CHS1）序列分析结合菌落特征对兔须癣毛癣菌分离株（31株）进行分型。结果显示菌落特征分为颗粒型、粉末型和绒毛型3种表型，其中多数为颗粒型和粉末型，占87.09%(27/31)，基于CHS1序列同源性差异，分成Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ5种基因类型，其中Ⅰ型和Ⅱ型是优势菌株，占54.84%(17/31)，这些提示CHS1序列分析可以用于须癣毛癣菌的基因分型。
　　采用SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法对兔须癣毛癣菌进行定量检测。结果表明,利用此方法可以检测病原菌DNA的最低稀释度为10-10,而常规PCR检测病原菌DNA最低稀释度为10-8。并且,特异性强，与犬小孢子菌、絮状表皮癣、红毛癣菌、白色念珠菌、烟曲霉等病原真菌没有交叉反应；对于须癣毛癣菌分离株阳性检出率为100%（10/10），临床分离须癣毛癣菌阳性检出率为86%（54/63）。证明采用荧光定量PCR方法对须癣毛癣菌进行快速诊断具有良好的可行性。
　　对31株须癣毛癣菌对药物的敏感性进行了研究。我们采用了11种常用抗真菌药物利用纸片扩散法进行了药敏试验,结果表明:特比萘芬、克霉唑、伏立康唑对须癣毛癣菌的抑制作用最强,31株菌对这三种药物敏感率为100%，抗菌效果最好；其次为伊曲康唑、酮康唑、益康唑、两性霉素-B、制霉菌素、咪康唑，31株菌对这几种药物的敏感率分别为93.55%、90.32%、83.87%、48.39%、32.26%、12.90%；5-氟胞嘧啶、氟康唑的抑菌效果最差，31株菌对其敏感率都为0%。
　　通过对兔场须癣毛癣菌病原菌的分离培养及rDNA-ITS序列分析,对兔须癣毛癣菌进行了鉴定；并基于几丁质酶基因对分离到的31株兔须癣毛癣菌进行了基因分型；建立了兔须癣毛癣菌SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法；通过进行兔须癣毛癣菌药物敏感性试验,进一步了解了兔须癣毛癣菌对抗真菌药物的敏感性,为临床用药提供参考。