水稻基因AL2调控叶绿体内含子剪接的分子机理研究

摘要

叶绿体通过光合作用合成植物激素和生产代谢产物，对植物正常的生长和发育过程起着重要的作用。叶绿体的形态结构、叶绿素的含量与植物的光合作用及其生长发育密切相关。叶绿体发育的缺陷通常会导致植物叶色的变异，因而叶色突变体是研究植物叶绿体发育和光合作用的理想材料。尽管一些参与叶绿体分化和发育的基因或调控基因已经被分离和鉴定，但是叶绿体分化和发育的分子机理仍有待于进一步研究，新基因的鉴定和功能分析对于深入了解叶绿体分化和发育仍十分重要。
　　本实验室前期通过对T-DNA插入突变体库（粳稻中花11背景）进行表型筛选，得到了一系列的白化苗突变体，称之为albino leafmutants（als）。本实验室已对albino leaf1（al1）进行了详细的鉴定和分析。因此，本研究着重对突变体albino leaf2（al2）开展相关的研究。获得了以下结果：
　　1、表型分析表明，突变体al2在萌发出芽后即表现出明显的白化表型，整个植株全白，生长至三叶期幼苗死亡；叶绿素含量测定结果表明，突变体al2的叶绿素含量几乎为零，显著低于野生型中花11（ZH11）。
　　2、透射电镜观察结果表明，在早期的发育阶段，突变体al2叶片的叶绿体结构即存在着严重的缺陷，无法形成完整的类囊体结构，最终导致叶绿体整体的降解。
　　3、实验室前期工作已证实T-DNA插入基因Loc_Os09g19850的第9个外显子导致了突变体al2出现白化表型。RT-PCR的结果表明，由于T-DNA的插入导致了基因Loc_Os09g19850不表达，初步证实了al2的突变表型受Loc_Os09g19850基因所控制，即Loc_Os09g19850就是水稻基因AL2（Albino Leaf2）的候选基因。水稻基因AL2具有9个外显子和8个内含子，编码了一个叶绿体内 IIA型内含子剪接因子 CRS1（chloroplast group IIA intron splicing facilitator）。
　　4、功能验证结果进一步证实Loc_Os09g19850就是水稻基因AL2。获得5个独立的Loc_Os09g19850互补转基因株系，经表型观察、叶绿素含量测定和qRT-PCR等证实基因 Loc_Os09g19850的表达可恢复突变体 al2的表型；获得了6个独立的Loc_Os09g19850反义转基因株系，经表型观察和 qRT-PCR等证实基因Loc_Os09g19850的功能丧失可重现突变体al2的表型。
　　5、AL2启动子与GUS基因融合表达的结果表明，AL2从种子萌动起就开始表达，一直到成熟期；幼苗阶段除在幼叶等绿色组织表达外，也在胚根鞘和根毛等非绿色组织表达；在成熟叶中表达最强，在穗、颖花、茎和叶鞘等均表达；组织切片显示，AL2在茎的内皮层也表达。qRT-PCR的结果也表明AL2在根、茎、叶、幼穗和成熟穗中均表达，其中在叶中表达最强。另外，亚细胞定位结果表明AL2蛋白定位于叶绿体。
　　6、已有的报道证实CRS1在拟南芥和玉米中调控了叶绿体atpF基因的IIA型内含子的剪切。本研究发现，atpF基因在突变体al2中的表达显著低于其在野生型的表达，暗示AL2基因在水稻中亦编码了一个有功能的CRS1。同时，对叶绿体内含有IIB型内含子的ndhA、ndhB、petD和ycf3等基因和含有I型内含子的trnL基因的qRT-PCR结果表明，AL2极有可能参与了水稻叶绿体内含有IIB型和I型内含子的基因的剪接调控。
　　7、对突变体al2中叶绿体相关基因的表达进行了qRT-PCR分析，结果表明：AL2基因的功能丧失显著下调了OsHAP3A、OsHAP3B、OsHAP3C、OsPPR1、YGL1、Cab1R、Cab、HemA和Cao等叶绿素生物合成相关基因（chlorophyll biosynthetic genes，CBGs）以及psbO、psaD、psaE、psbP、lhcb2和rbcS等核编码的叶绿体基因（nuclear-encoded chloroplast genes，NECGs）的表达；同时还下调了psaA和psbA两个质体编码的多聚酶（plastid-encoded polymerase，PEP）的表达，但对psaB和rps14两个PEP以及atpA、petA、rpoB和rps2等核编码的多聚酶（nucleus-encoded polymerase，NEP）的表达无作用。因此，AL2是通过协同部分叶绿体相关基因的表达来调控水稻叶绿体发育。
　　总之，本研究鉴定了一个与水稻叶绿体发育相关的基因AL2，该基因的功能丧失导致了突变体 al2的白化表型；分子克隆和功能分析证实 Loc_Os09g19850就是水稻基因AL2，它编码了一个叶绿体内IIA型内含子剪接因子CRS1；qRT-PCR结果表明AL2极有可能参与了水稻叶绿体内含有IIB型和I型内含子的基因的剪接调控，并且是通过协同部分叶绿体相关基因的表达来调控水稻叶绿体发育。本研究为进一步研究水稻CRS1基因调控叶绿体发育的分子机理奠定基础。

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目录

1 文献综述

1.1 叶色突变体的来源

1.2 叶色突变体的表型与叶绿素含量的关系

1.3 叶色突变体的表型与叶绿体的结构

1.4 叶色变异的遗传方式

1.5 叶色突变的分子机制

1.6 叶绿体基因组的结构与表达调控

1.7 本研究的目的和意义

2 材料与方法

2.1 供试植物材料

2.2 材料种植

2.3 主要试剂

2.4 主要仪器设备

2.5 叶绿素含量的测定

2.6 透射电子显微镜观察样品的制作

2.7 GUS活性组织化学染色

2.8 引物的设计与合成

2.9 水稻总DNA的提取

2.10 水稻原生质体GFP蛋白的瞬时表达

2.11 水稻总RNA的提取

2.12 反转录第一链的合成

2.13 内参基因actin的检测

2.14 基因表达的RT-PCR分析

2.15 基因表达的qRT-PCR分析

2.16 进化树的构建

3 结果

3.1 叶色突变体al2的表型

3.2 叶色突变体al2的叶绿体超微结构

3.3 水稻基因AL2候选基因的分析

3.4 水稻基因AL2的功能验证

3.5 水稻基因AL2的表达模式

3.6 水稻AL2基因参与叶绿体基因内含子的剪接

3.7 叶绿体相关基因的表达

4 讨论与结论

4.1 讨论

4.2 结论

致谢

参考文献

附录A 相关载体构建所用引物

附录B 水稻木村B水培营养液（1000×）

附录C 水稻AL2蛋白序列（948AA）