‘井岗红糯’荔枝嫁接亲和性及其机理研究

摘要

植物嫁接成活过程等同于砧穗愈合过程，是不同植物的器官、组织或细胞相互作用，最后结合成为一个整体的过程。嫁接愈合过程要比伤害愈合过程复杂，它涉及到组织学、细胞学、遗传学等多方面问题。前期国内外学者从形态解剖学、生理生化、遗传特性等方面对植物嫁接亲和机制进行了深入探讨。本研究以‘井岗红糯’为接穗品种，观测了‘井岗红糯’与其它荔枝品种嫁接亲和性，在分析生理生化指标与嫁接亲和性的相关性的基础上，通过石蜡切片观察亲和组合和不亲和组合解剖结构的差异；并利用RNA-seq测序，研究了荔枝嫁接亲和组合与嫁接不亲和组合愈合过程中愈合处茎段基因表达谱的变化，筛选亲和与不亲和组合间差异表达基因，以期弄清荔枝嫁接（不）亲和性的分子机制，主要结果如下：
　　1、分析了‘井岗红糯’作为接穗品种，嫁接在‘六月雪’、‘宋家香’、‘雪怀子’、‘状元红’、‘怀枝’、‘白糖罂’、‘桂林’、‘黒叶’、‘进奉’、‘晚埔’、‘早埔’、‘双肩玉荷包’、‘乌叶’等荔枝品种上，经过两次嫁接亲和性评价，结果表明，用‘六月雪’、‘白糖罂’、‘怀枝’作为砧木品种接接穗品种‘井岗红糯’亲和性良好，其亲和性分别为60.0％、45.6%和43.3%。另外，观察不同砧穗组合嫁接后的表现，发现嫁接亲和性组合不仅具有较高的成活率,而且嫁接亲和组合叶片的叶绿素含量更高，净光合速率也较高。
　　对嫁接9个月后各组合接穗叶片的SOD、POD、PPO等嫁接亲和相关酶活性分析表明，叶片的相关酶活性越高，其组合嫁接亲和性越高。接穗叶片SOD活性与嫁接亲和性相关系数为0.459；POD活性与嫁接亲和性相关系数为0.521；PPO活性与嫁接亲和性相关系数为0.620，相关系数均达到显著水平。说明嫁接亲和关联酶在嫁接愈合过程中发挥了重要作用，在亲和性较好的组合其酶活性也较高。
　　2、运用流式细胞仪以及SCoT分子标记分析，分析了‘进奉’、‘黒叶’、‘怀枝’等13个砧木品种及‘井岗红糯’接穗品种的亲缘关系，结果表明，嫁接亲和性较高的组合，其砧木品种的基因组大小与接穗品种‘井岗红糯’的基因组大小更加接近，且其遗传关系与接穗品种越相近。同时测定砧木和接穗荔枝品种叶片的干重、水势、糖、氮、磷和钾、可溶性糖、蛋白、淀粉、相对电导率和总酚的含量，我们发现与嫁接亲和性显著相关的生理生化指标有叶片干物质重、叶片可溶性糖含量。因此，可以通过比较两种荔枝品种间的上述生理生化指标来预测两者的嫁接亲和性。石蜡切片观察表明，亲和性良好的组合，砧穗间的离层基本消失，维管束桥形成；而亲和性差的组合愈合处隔离层仍然存在，愈合处两侧细胞中细胞器少，鲜见维管束桥连通。
　　3、利用RNA-Seq技术分析了不同亲和性组合愈合处愈合过程中数字表达谱变化，共检测到了30408个genes表达，其中符合筛选条件的差异表达genes中，嫁接亲和组合有6060个差异表达基因，嫁接不亲和组合有5267个差异表达基因。对两个组合中的显著差异基因进行等级聚类分析，得到四大类基因表达变化模式，并发现了大量的转录因子家族（如MYB、WRKY、NAC等），经过GO、KEGG、COG、WGCNA分析，富集较多的途径主要有苯丙氨酸代谢途径、信号转导途径、响应刺激以及抗氧化活性等方面。经过综合分析，筛选出与嫁接亲和性相关的途径有信号转导途径、IAA生物合成以及信号传递相关途径以及木质素合成途径。从转录组中还筛选得到16条与已知木质素合成途径相关基因，并用Q-PCR技术对RNA-Seq结果进行验证，结果表明表达谱测序的结果是准确可信的。
　　4、对LcPOD和LcPAL等荔枝木质素合成关键基因的序列、表达及功能进行了研究。氨基酸序列比对和进化树显示，LcPOD蛋白与杨树的POD蛋白同源性最高。LcPAL1与柠檬（Citrus limon）中的PAL编码的氨基酸序列同源性最高，为81.98%，LcPAL2与山茶（Camellia japonica）中的PAL编码的氨基酸序列同源性最高，为77.02%。LcPOD和LcPAL在不同嫁接组合愈合的不同时期中均有表达，在嫁接亲和组合中表达丰度显著高于不亲和组合。转LcPOD和LcPAL烟草木质素含量高于未转基因烟草。对转基因烟草进行嫁接实验发现，长势最好的是LcPAL1-line2/CK和CK/LcPAL1-line2，其次是LcPAL2-line2/CK和CK/ LcPAL2-line2，它们的PAL活性都明显高于非转基因烟草的PAL活性。而长势最差的为LcPOD1-line1/CK和CK/LcPOD1-line1。对LcMYB进行定位和功能研究发现，LcMYB定位于细胞核中，并且具有调控木质素合成基因PAL和C3H的功能。

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第一章 前言

1.1 研究背景

1.2研究目的和意义

1.3研究技术路线

第2章 嫁接亲和性的评价

2.1引言

2.2 材料与方法

2.3 结果与分析

2.4 讨论

2.5本章小结

第3章 嫁接亲和性早期鉴定指标筛选

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.3结果与分析

3.4 讨论

3.5 本章小结

第4章 嫁接组合转录组特征与亲和相关基因分析

4.1引言

4.2 材料与方法

4.3 结果与分析

4.4 讨论

4.5 本章小结

第5章 LcPOD和LcPAL的功能验证

5.1 引言

5.2 材料与方法

5.3 结果与分析

5.4 讨论

5.5 本章小结

第6章 全文讨论与结论

6.1全文讨论

6.2 全文结论

本文的创新性

致谢

参考文献

在读期间发表论文及奖励

附录A SCoT引物序列

附录B qRT-PCR所选基因引物序列

附录C生长素相关的差异表达基因的qRT-PCR验证

附录D 嫁接亲和组合与嫁接不亲和组合嫁接后不同时期愈合处IAA含量测定

附录E 木质素合成相关基因的qRT-PCR验证

附录F转基因烟草嫁接后生长情况

附录G克隆基因序列