家蚕微孢子虫Met-AP2基因验证与烟曲霉素治疗效果检测

摘要

微孢子虫可以感染几乎所有动物，包括大多数的昆虫，微孢子虫和微孢子虫病的研究一直是病理学领域的研究热点。家蚕微孢子虫病既可以通过水平传播，也可以经胚胎传播，威胁着各养蚕国家的蚕桑产业的健康可持续发展，因此家蚕微孢子虫病是蚕业生产上最重要的检疫防控对象。自从在人肠道微孢子虫病治疗研究中发现烟曲霉素及其衍生物、类似物均具有明显的治疗效果，且作用的靶位点是Met-AP2基因，这为家蚕微孢子虫病的治疗机理研究提供了方向。故本课题拟在家蚕微孢子虫基因组和转录组数据库中筛选寻找家蚕微孢子虫Met-AP2基因的存在基础上，尝试应用对人微孢子虫病治疗有效的药物烟曲霉素对家蚕微孢子虫病进行模拟治疗研究，探讨药物处理前后在人工感染家蚕微孢子虫的家蚕组织中微孢子虫Met-AP2基因的变化规律，以期为家蚕微孢子虫病的治疗提供实验参考和理论依据。
　　本论文在课题组前期开展家蚕微孢子虫基因组和转录组（广东株）研究基础上，通过生物信息学方法筛选出与烟曲霉素药物治疗相关靶基因Met-AP2进行了PC R测序验证及检测应用研究，并对其基因功能及其在家蚕组织中的不同侵染阶段的表达功能等进行了分析研究，旨在为家蚕微孢子虫病有效治疗提供分子依据。
　　结果如下：
　　（1）家蚕微孢子虫Met-AP2基因的验证及生物信息学分析
　　在对家蚕微孢子虫的转录组数据中推断的Met-AP2基因进行PC R克隆测序验证，经不同引物测序验证发现相似性都在93％以上，其中MC-F/R引物测序结果与转录组数据相似性高达99.9%；以引物MC-F/R，2047F/R对其他家蚕常见病原微生物及4种昆虫微孢子虫中 Met-AP2基因的特异性，敏感性进行 PCR鉴别，并以引物 MC-F/R对相应片段进行克隆测序分析。发现家蚕微孢子虫（广东株）只存在一个Met-AP2基因，开放阅读框1077 bp，共编码358个氨基酸，其编码蛋白的分子量约为45kDa，为疏水的稳定蛋白。Met-AP2基因序列上没有预测的信号肽糖基化位点及跨膜结构域，其蛋白结构中存在典型的α–he lix元件。
　　（2）建立了原核重组质粒pET-28a–me t
　　使用 pET-28a载体，Rosetta感受态细胞，对 Met-AP2进行原核表达，并通过SDS-PAGE和Western blot验证其分子量为45KDa，与预测结果相符。对融合蛋白进行镍琼脂糖亲和层析纯化后得到纯度较高的蛋白。
　　（3）家蚕微孢子虫烟曲霉素治疗效果验证及Met-AP2靶基因应用
　　对正常家蚕、感病家蚕、只添食药物烟曲霉素家蚕和感病后烟曲霉素治疗的家蚕进行了比较观察，发现添食药物之后的家蚕表面无明显的病斑。同时筛选了5对以Met-AP2基因为靶基因的LAMP引物，选了其中一个效果较好的引物 LM1，优化了合适的内外引物配比和扩增温度，创新地建立一套基于Met-AP2基因的家蚕微孢子虫LAMP检测方法。同时通过对添食药物前后不同时期中肠组织的进行了LAMP检测，从分子水平上验证了烟曲霉素治疗家蚕微孢子虫病的效果，为生产上推进应用烟曲霉素药物治疗家蚕微孢子虫病提供实验参考。

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1.前言

1. 1微孢子虫概述

1. 2 家蚕微孢子虫病的发病及流行

1. 3 微孢子虫病的诊断

1. 4 微孢子虫的治疗

1. 5 烟曲霉素

1.6 Met-AP2基因的研究概述

1.7 烟曲霉素抑制Met-AP2的作用机理

1. 8 本论文研究意义及内容

2. 材料与方法

2. 1 材料

2. 2 方法

3 结果与分析

3. 1 烟曲霉素对家蚕微孢子虫病治疗结果

3.2 家蚕微孢子虫（广东株）转录组的Met-AP2基因测序结果的PCR验证

3.3 家蚕微孢子虫Met-AP2基因的生物信息学及分析

3.4 家蚕微孢子虫Met-AP2蛋白的原核表达

3.5 基于Met-AP2靶基因的LAMP方法在烟曲霉素治疗效果检测上的应用

4 讨论与结论

4. 1 讨论

4. 2 结论

致谢

参考文献

附录A

附录B

攻读学位期间的学术成果