犬细小病毒灭活疫苗的制备及效果观察

摘要

犬细小病毒（Canine Parvovirus,CPV）感染普遍存在于世界各地犬科动物中，引起较高的发病率和死亡率，导致养犬业及宠物业经济损失惨重，对野生动物的生存也产生了非常大的影响，而目前对该病尚未发现有效的治疗对策，疫苗的开发免疫是有效预防CPV流行的关键，但CPV存在抗原漂移，所以根据CPV流行和抗原特异性来制备相应的灭活疫苗，对预防目前国内CPV的流行意义重大。
　　本试验首先将实验室近来分离保存的CPV-S5（New CPV-2a基因亚型）与CPV-1401（New CPV-2b基因亚型）毒株分别在F81细胞上扩大培养，通过病毒培养条件的优化试验确定CPV的最佳生长条件，以此培养较高滴度且足够量的病毒液来制备浓缩与未浓缩灭活疫苗；接着通过高浓度盐离心浓缩与小型切向流超滤浓缩两种浓缩方法对细胞培养液进行浓缩；之后将浓缩的病毒液与未浓缩的病毒液与终浓度为0.05％β-丙内脂4℃条件灭活24h，37℃水浴2h；经在F81细胞上进行灭活鉴定后，参考本实验室刘晓慧制备疫苗的方法，将水溶性佐剂MONTANIDE GEL和灭活病毒液按1：9比例混合，再通过无菌及理化性质的鉴定，结果显示所做的三批疫苗所用的病毒液均灭活成功，无菌鉴定阴性，外观透明无浑浊现像，免疫犬后均未见明显的临床副反应，且有效的刺激犬产生特异性免疫应答，表明成功制备了安全、有效的浓缩CPV与未浓缩CPV水溶剂灭活疫苗。
　　将第一批水溶剂灭活疫苗和商品化犬细小弱毒苗分别接种5周龄未免疫且HI抗体效价阴性的幼犬，分别在免疫后0 d、7d、14 d、21d、28 d通过HI试验对处理过的血清进行抗体效价测定，结果显示所有免疫组在第7d都能产生高于1：80的HI抗体效价，浓缩组要显著高于未浓缩组，初步表明 CPV灭活疫苗效果与抗原的浓度有直接的关系；灭活疫苗组与商品化弱毒苗组均差异显著。对试验犬免疫36d后进行攻毒实验，攻毒后20d内，免疫组的犬均未见明显临床症状，仅2只犬产生轻微症状但最终耐过，而 HI抗体效价阴性犬死亡，经检测死亡犬CPV为阳性，表明制备的CPV灭活疫苗产生的特异性免疫应答能抵抗强毒的攻击，对犬起到很好的免疫保护。对攻毒过后的犬继续加强免疫第二批灭活疫苗，加强免疫10d后对所有犬CPV检测，过后取高免血清，结果显示CPV阴性且高免血清平均HI效价为1：3072。灭活疫苗首免抗体效价及持续时间有限需加强免疫，故首免36d后进行二免，结果显示其HI抗体效价极显著提高，有效抗体能维持6个月，进一步有效的对免疫犬群进行保护。
　　将第三批水溶剂灭活疫苗分别接种3月龄未免疫且HI效价阴性的比格犬，分别在7d、14 d、21d、28 d通过HI试验对处理过的血清进行抗体效价测定，结果显示犬在第7d的HI抗体效价达到1：448，其抗体消长规律与第一批浓缩CPV-S5灭活疫苗组总趋势一样，表明制备的灭活疫苗免疫效果重复性较稳定，且进一步证明其免疫效果与抗原浓度有直接关系。

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目录

1前言

1.1 CPV生物学特性

1.2 CPV的分子生物学特性

1.3 CPV抗原检测研究

1.4 CPV抗体检测研究

1.5 CPV的预防治疗

1.6 疫苗研究进展

1.7 本研究目的与意义

2 材料与方法

2.1 材料

2.2 方法

3 结果与分析

3.1 CPV的增殖

3.2 细胞培养液PCR检测

3.3 CPV生长曲线的确定

3.4 病毒的浓缩

3.5 CPV的灭活效果检验

3.6灭活疫苗的制备

3.7灭活疫苗实验室检验

3.8抗体消长规律

3.9 二免后抗体消长规律

3.10 攻毒实验

3.11 第三批疫苗的免疫效果

3.12 高免血清制备

4 讨论

4.1 CPV灭活疫苗的制备

4.2 CPV灭活疫苗的免疫效果

全文总结

致谢

参考文献

附录：攻读硕士期间发表学术论文