保健食品中他达那非类药物免疫检测方法研究

摘要

他达那非作为第二代磷酸二酯酶-5（PDE-5）抑制剂，是一种治疗男性勃起功能障碍的处方药，经常被非法添加到声称具有抗疲劳、增强免疫力、补肾壮阳等功能的保健食品中。但此类药物与硝酸酯类药物同时服用会引起低血压，甚至死亡。因此，加强对此类药物非法添加的监控对保障食品安全至关重要。目前，此类药物的检测主要依赖于液相色谱、气相色谱及色谱质谱联用等大型仪器手段。但是，大型仪器分析方法检测成本高、需要专业的操作人员、且不能进行现场监控，难以普及，尤其是在经济支持薄弱的基层单位。免疫分析法是运用抗原抗体反应与酶促反应相结合的一种快速、灵敏、低成本、易于现场操作的检测技术，可与大型仪器确证技术形成互补，高低搭配，满足大批量样品的快速、筛查确证检测需求。目前，有关PDE-5抑制剂他达那非类药物的免疫检测方法尚未见报道。因此，本文以他达那非为对象，开展半抗原/抗原设计合成、动物免疫及宽谱特异性抗体制备、间接竞争酶联免疫分析方法和胶体金免疫层析试纸条等研究。主要研究内容和结果如下：
　　（1）以氨基他达那非为原料设计合成出了5种半抗原 H1~H5，并通过偶联载体蛋白进行动物免疫及抗血清的筛选，制备得到了2种高效的能够特异性识别他达那非类药物的抗体PAb-H5-AmTD-MA和PAb-H5-AmTD-MA-KLH，在1μg/mL他达那非药物条件下，其抑制率分别为89％和95%。
　　（2）基于PAb-H5-AmTD-MA抗体建立了检测他达那非类药物的间接竞争酶联免疫分析（ic-ELISA）方法。通过优化确定了最佳反应参数：包被原浓度为32.15 ng/mL，抗体稀释倍数为8 k，药物稀释缓冲液为pH8.4的0.01 mol/L含0.2%吐温-20的PBST，竞争反应时间为40 min，二抗反应时间为30 min，显色时间为10 min，体系中甲醇浓度控制在5%以内，建立了ic-ELISA方法，该方法对他达那非的检测限（LOD）为0.027 ng/mL、IC50为0.90 ng/mL、线性范围（IC20-IC80）为0.099~8.22 ng/mL；保健酒、胶囊等固体和液体保健食品样品中他达那非的平均添加回收率在84.92%~116.19%之间，变异系数在6.37%~14.28%之间，与 HPLC-MS/MS方法检测结果相关性良好（R2=0.9993）。
　　（3）基于 PAb-H5-AmTD-MA-KLH抗体制备了检测他达那非类药物的胶体金免疫层析试纸条（GICA）。通过柠檬酸还原法烧制了~16nm的胶体金溶液，并优化确定了最佳方法条件为：胶体金标记抗体时胶体金溶液 pH值为8.5、抗体用量为0.75μg/mL；金标抗体及包被原浓度均不稀释最佳，此时金标抗体浓度为原始胶体金溶液的1/10，包被原浓度为1 mg/mL；最佳的样品垫膜材质为GF-06；样品垫处理液为0.2 M pH7.5 Tris-HCl缓冲液；药物稀释液为0.01 M pH7.4的PBST，其甲醇含量最好不超过5%；质控线二抗稀释倍数为30倍，此时二抗浓度为0.27 mg/mL，进一步构建了定量分析GICA试纸条，对他达那非的检测范围为0.71~141.99 ng/mL，IC50为10.04 ng/mL；保健酒、胶囊等固体和液体保健食品样品中他达那非的平均回收率在93.34%~121.50%，平均变异系数在0.95%~13.33%，与HPLC-MS/MS方法检测结果相关性良好（R2=0.9598）。
　　（4）采用以上两种方法对保健酒类液体样品及固体样品盲样进行检测，发现9种保健酒中有3种检测为阳性，13种固体样品中有4种检测出为阳性，且含量均在μg/mL以上；与 HPLC-MS/MS方法检测结果相关性良好，相关系数平方（R2）分别为0.9758（ic-ELISA）、0.9287（GICA）。

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1 前言

1.1 他达那非简介及其危害

1.2 他达那非等PDE-5抑制剂残留现状

1.3 他达那非类药物检测方法研究现状

1.4 免疫分析方法

1.5 本研究的目的意义、内容及技术路线

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 试验方法

2.3 间接酶联免疫分析方法的建立

2.4 胶体金免疫层析试纸条的制备

3 结果与分析

3.1 半抗原的设计

3.2 半抗原合成及结构鉴定

3.2 人工抗原的合成与鉴定

3.3 人工抗原偶联比的测定

3.4 抗血清的评价

3.5 基于抗体PAb-H5-AmTD-MA建立ic-ELISA方法

3.6 胶体金免疫层析试纸条的制备

4 讨论与结论

4.1 讨论

4.2 结论

4.3 创新点

4.4 展望

致谢

参考文献

附录A 作者攻读硕士学位期间发表论文情况

附录B 本研究所涉及的他达那非功能及结构类似物结构信息

附录C 他达那非半抗原结构鉴定质谱图及核磁图